我国主要疯草内生真菌分离鉴定及其进化分析.pdfVIP

中国畜牧兽医学会家畜内科学分会 中国·南昌 第七届代表大会暨学术研讨会论文集 经机能障碍为中毒特征的有毒植物总称t旧，是草原草场上危害最为严重的毒草种类之一。我国疯草 主要分布于内蒙古、甘肃、青海、西藏和四川等西部地区，据不完全统计【3】，我国疯草类有毒植物 有44种，其中造成严重毒性灾害的有13种，危害面积超过1100万lune，约占全国草场总面积的3％。 国外疯草灾害主要分布于美国和加拿大，共有354种黄芪属和22种棘豆属疯草【4】。美国西部地区和 西南部的新墨西哥州疯草中毒最为严重【5·61。疯草灾害给畜牧业的发展带来了严重的经济损失。 内生真菌(Fungalendophyte)是一些在其生活史中某一段时期生活在活的植物组织内，对植物组 织不引起明显病害症状的真菌，包括那些在其生活史中的某一阶段营表面生活的腐生真菌和对宿主 暂时没有伤害的潜伏性病原真菌和菌根菌吼目前研究发现疯草毒素与疯草内生真菌关系密切。一 方面疯草内生真菌协助疯草产生疯草毒素【8】，还有些疯草内生真菌，如埃里格孢菌【9】(Embellisia spp)， 绿僵菌【lo】(Metarhizium anisopliae)镰刀属内生真菌【11．12】可以在体外培养的条件单独产生疯草毒素． 苦马豆素，从而间接或直接的增强了疯草毒性。另一方面疯草内生真菌可以提高疯草的抗逆性113,14]， 如抗高温、抗干旱、抗酸碱、抗氮磷钾等矿物质元素的缺乏等。这使得疯草在我国西部干旱半干旱 的草原上生命力显得极其顽强，加大了疯草灾害防治的难度。疯草促使草场退化破坏草地生态平衡． 降低草场利用率，疯草的出现是草原退化的一个重要标志。本研究拟对采自我国西部草原的危害最 为严重的五种疯草，即甘肃棘豆、小花棘豆、黄花棘豆、急弯棘豆和变异黄芪进行内生真菌的分离 与鉴定，旨在探明内生真菌在疯草内的分布特点，为疯草内生真菌的种群分布特征和遗传多样性的 研究奠定基础，同时为疯草灾害的防治提供理论依据。 1材料与方法 1．1样品采集 疯草样品于2009年8月采自内蒙古阿拉善左旗和吉兰泰，青海西宁市郊的西沟和日月乡本炕村。 详细记录采样地点的地理信息和植物生长阶段与环境类型。采用牛皮纸和冰盒对植物样品做现场保 存后送回实验室于-20℃保存，以供内生真菌菌种的分离。 1．2试剂与仪器 (Bio-Rad)。 1．3试验方法 1．3．1内生真菌分离与保存 分别取冰冻保存的的疯草花、茎、叶、果植物样品49，先用无菌水清洗，置O．1％十二烷基苯磺酸 S， 钠溶液浸泡30min，取出再经无菌水冲洗干净，然后进入表面消毒程序：75％乙醇漂洗3060 无菌水浸泡并清洗，O．1％升汞溶液漂洗2～5min，再用无菌水冲洗。取最后一次冲洗所得无菌水O．1 750 中国畜牧兽医学会家畜内科学分会 中国·南昌 第七届代表大会暨学术研讨会论文集 mL滴入PDA培养基平板，25℃培养48h，观察培养基表面有无菌落生长，以验证表面消毒是否彻 底。将表面消毒彻底的样品剖开，剪成小组织块，植于PDA培养基，25C培养3～5d，待组织创缘 菌丝长出时，用接种针挑出菌丝并接入新的PDA培养基，如此纯化培养3～4次，得到纯化菌株， 并予以编号。按照上述方法分离纯化得到的菌株，弃除常见的青霉、黄曲霉、黑曲霉等杂菌后，分 表1 疯草采集地点地理性息，采集时期和生长环境 l The Table andhabitatof samples locations，period Oxytropis．flabra 疯草，采集地点(编号) 采地坐标 海埤高度 生长时期 草原类型与土壤类型 Locations(No．) GPS GrowthPeriod LandFormsandSoil