SD大鼠骨髓间充质干细胞培养流程.docVIP

SD大鼠bone mesenchymal stem cells，BMSCs)起源于中胚层，是优质的种子细胞，亦是骨髓中存在的除造血干细胞外的另一类干细胞。由于取材相对方便，易于体外扩增，以及免疫原性低等优势，已经在组织工程和移植领域得到了广泛的关注。但是骨髓间充质干细胞在骨髓中的含量非常少，在骨髓中，BMSCs占骨髓有核细胞总数0.001%~0.1%，含量极低。而同时，由于组织工程需要大量的种子细胞，从啮齿类动物骨髓分离BMSCs的技术上的难度限制了许多实验的开展。体外分离培养纯度高、活力强、生物特性均一的BMSCs对组织工程及细胞的体内、体外实验显得至关重要。 研究目的 本实验通过BMSCs的黏附特性，应用全骨髓贴壁培养法，建立了一个简便、有效的原代培养、增殖和纯化BMSCs的方法，观察大鼠BMSCs的生物学特性，为后续利用BMSCs治疗血液疾病的研究提供稳定的干细胞模型。 一、实验材料与方法 （一）材料与试剂 生后30d的雄性SD大鼠，体质量100g，SPF级；DMEM培养基；青霉素、链霉素；胎牛血清；淋巴细胞分离液；0.25%胰蛋白酶；兔抗鼠CD34、CD44、CD45、CD105、CD90荧光抗体；CO2培养箱；倒置相差显微镜；SW-CJ 型生物洁净工作台。 （二）方法 BMSCs的原代分离培养：2%戊巴比妥钠麻醉大鼠，体积分数75%乙醇全身浸泡消毒10 min。无菌条件取股骨及胫骨，PBS清洗3次。剪掉股骨和胫骨的骨骺端，露出骨髓腔，用添加青、链霉素的L-DMEM培养基冲出骨髓，反复吹打；将冲出的骨髓制成单细胞悬液。将冲洗下来的液体制成单细胞悬液，经Percoll密度梯度离心法，分离和收集有核细胞，用含15%胎牛血清的DMEN-LG培养基重悬离心管中的骨髓间充质干细胞，镜下细胞计数，使细胞密度达到1X106个/ml，CO2培养箱培养，换液，将骨髓间充质干细胞不断纯化。当细胞生长融合达80%-90%时，用1:1的0.25%胰蛋白酶和0.02%乙二胺四乙酸溶液消化分散细胞，在显微镜下控制消化时间，计数细胞，以1:3密度扩增培养。此时标记为P1代。 BMSCs的培养、纯化及传代：原代培养过程中，48h后全量更换培养基，以后每3d全量更换新鲜培养基。待细胞铺满培养瓶底至细胞融合成单层，密度长至70%~80%融合时，用0.25%胰酶消化，1：2的比例进行传代培养。 BMSCs的形态学观察及Giemsa染色：培养后每日用倒置相差显微镜观察细胞形态变化及生长状况并拍照。将纯化后的第2代细胞调整细胞浓度至5×107 /L，接种到12孔细胞培养板中，每孔接种0.75mL，以后每3d换液。待细胞分布均匀、约80%融合时，PBS洗3次，甲醇固定10min，Giemsa染液染2min，蒸馏水冲洗，显微镜下观察拍照。 BMSCs生长曲线测定：将生长状态良好的SD大鼠骨髓间充质细胞传至2代并接种于96孔培养板，接种密度5×103/孔，将培养板移入CO2培养箱中培养。每日取一板进行MTT检测。选择492nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值，记录结果。以时间为横轴，光吸收值为纵轴绘制细胞生长曲线。 BMSCs的细胞周期检测：取第3代细胞，调整细胞浓度为1.0×109 /L。加100μL RNase A 37℃水浴30 min，再加入400μL PI染色混匀，4℃避光30 min，流式细胞仪检测细胞周期。 BMSCs鉴定：流式细胞仪检测细胞表面标记：收获P3代生长状态良好细胞，0.25%胰酶消化，4℃离心，1000r/min，5 min，用PBS(含1%BSA)清洗细胞3次，计数细胞，各管依次加入单克隆抗体CD34、CD44、CD45、CD90、CD105。同时每管样品设立同型阴性对照。避光冰上孵育45 min，用PBS(含1%BSA)洗涤细胞3次，以除去未结合抗体，用500μL PBS(含1%BSA) 重悬细胞，流式细胞仪进行检测分析。 二、讨论 MSCS这个概念是由Friedenstein和他的同事在40多年前提出的。随后的研究发现其具有向骨、软骨、脂肪、肌肉、肌腱及骨髓间质等多种间充质组织分化的潜能,近来又有研究发现BMSCs与肿瘤的发生、发展有着重要的联系。因此,如何培养出高纯度、稳定的BMSCs,是进行更深一步研究的基础。 骨髓中间充质干细胞的含量较低,约为0.001%～0.01%。目前用于分离BMSCs的方法主要有四种:贴壁法、流式细胞仪分离法、密度梯度离心法和免疫磁珠法。贴壁细胞分离法是最早的方法,是根据MSC具有在塑料组织培养瓶中贴壁生长的特性对其进行分离;但所得细胞的成分复杂,骨髓间充质干细胞的纯度不足。密度梯度离心法是根据BMSCs与其他细胞的密度不同而采用Percoll将其分离出来;使用Percoll分离液密度梯度离心的