牛轮状病毒HQ09株的分离与鉴定.pdf

摘要 摘 要 牛轮状病毒(Bovine (Rotavirus)，是引起犊牛病毒性腹泻的主要病原之一。本课题将从2009年黑龙江省齐齐哈 尔市某养殖场获得一份犊牛腹泻粪便，进行滤菌处理后，于MAl04细胞中连续传代，传至 384 第15代时测得为104 TCID50／1009l；使用电镜观察病毒粒子形态，可以看到直径大小约 70nm，呈典型车轮状的病毒粒子；通过核酸类型实验、脂溶剂敏感性实验，证实该病毒为 无囊膜的RNA病毒；该病毒耐酸，经50℃水浴30min处理，感染能力下降明显；通过病毒 中和实验，将病毒液与牛轮状病毒参考株阳性血清发生中和反应，中和抗体效价达l：145。 根据以上初步鉴定结果推测该分离到的病毒为牛轮状病毒，并命名为HQ09株。 根据GenBank中牛轮状病毒NCDV株的序列设计引物，通过RT-PCR扩增了BRV HQ09 物信息学分析：结果表明HQ09VP6基因的CDS区长度是1194bp，编码一个长度为398个 氨基酸的蛋白质，系统遗传进化树分析发现分离株HQ09与标准株NCDV、北美B223处在 一个分支，核苷酸同源性分别为99．6％、87．8％，我们得出BRV HQ09属于A群轮状病毒； 分离株HQ09VP4基因的CDS区长度是233lbp，编码一个长度为777个氨基酸的蛋白质， 系统遗传进化树分析发现HQ09与P[11型的标准株NCDV、北美株OAgent、日本株A5、 中国山东分离株CHLY处在一个分支，核苷酸同源性分别为99．9％、97．2％、80．9％、99．6％， 表明HQ09为P[1]型；HQ09 VP7基因的CDS区长度是981bp，编码一个长度为327个氨 基酸的蛋白质，系统遗传进化树分析表明HQ09与G6型的标准株NCDV、北美疫苗株WC3、 阿根廷株1730、中国山东分离株CHLY处在一个分支。核苷酸同源性分别为98．9％、97．4％、 98．7％、99．6％，上述结果表明BRV HQ09为G6型。 以0．2 mL／只的剂量用BRVHQ09株对小鼠进行灌胃攻毒，感染小鼠出现腹泻，腹泻潜 伏期为1～2天，在3～4天腹泻现象较为明显，5～6天时腹泻现象消失；其临床症状表现 包括皮毛光泽差，嗜睡，攻击性强，排浅黄色稀软性粪便等；剖检变化为各段肠道均有不同 程度的臌气，肠壁变得菲薄，肠内充满黄色稀薄的黏液样或水样内容物；小肠病理组织学变 化明显，肠腺和肠绒毛上皮细胞增生、肿胀、黏液变性、坏死和脱落，小肠绒毛顶端破损， 有大量内容物弥散在肠道中，黏膜固有层呈轻度细胞浸润，腺体萎缩破坏。动物实验结果进 一步证实小鼠可作为BRV感染动物模型。 关键词：牛轮状病毒；分离；鉴定；进化 ABSTRACT ISOLATIONAND OF STRAIN BOVINEROTAVIRUS HQ09 ABSTRACT Bovine tothereovirus the rotavirus(BRV)belongs in obtained causativeofcalfviraldiarrhea．In2009QiqiharCit-y,HeilongjiangProvince，we agent anBRV viaMAl04cellcontinuous acalfdiarrheal isolated