易错PCR对扩展青霉脂肪酶基因PEL的定向进化.pdfVIP

安徽农学通报，AnhuiA ．Sci．Bul1．2011，17(05) 易错 PCR对扩展青霉脂肪酶基 因PEL的定 向进化 陈 彦 司圣乾 刘燕雅 冯蔚宗 林 琳 (福建师范大学生命科学学院，福建福州 350108) 摘 要：以带有野生型扩展青霉碱性脂肪酶cDNA全长的载体 psk—lip07为模板，利用易错PCR技术以及高通量筛 选，最终获得 了一株最佳突变体 GS—pPIC3．5K—llo07一ER04，其最适作用温度 比野生型提高 10~C，酶活提高了约 22％ ，热稳定性Tm值也提高了3．28~C。基 因测序结果表明，脂肪酶 (PEL)第 82位的Lys突变成Arg，第241位的Glu 突变成 Pro。 关键词：扩展青霉脂肪酶；易错PCR；最适作用温度；酶活；热稳定性 中图分类号 o556 文献标识码 A 文章编号 1007—7731f2011)O5—22一O3 扩展青霉碱性脂肪酶(PEL)是一种在碱性条件下具 1．2．1 易错PCR 利用易错 PCR的方法进行随机突变 ， 有非常好的催化三酰甘油酯分解作用的脂肪酶 J，其适宜 建立突变基 因库 ：用 Lip07作为模板 ，10raM 的 dATP， 的作用温度为20～39~C，热稳定性 Tm值为 39．4~C 。 ， dGTP，dCTP，d P终浓度分别为 0．2mM，0．2mM，1mM， 该酶的编码基因共g55hp，由285个氨基酸组成 ，成熟肽的 1mM；25mM的Mg“终浓度为 7ram；10ram的Mn“终浓度 分子量为27．3kDa 。本课题组克隆并在毕赤酵母中高 为0．1mM，进行 PCR扩增 ，从而获得含有大量突变基因的 效表达了该脂肪酶 ，发酵条件优化、高拷贝工程菌构建等 突变基 因库 (1ip07一mutantx)。 工作的进行使异源表达的扩展青霉脂肪酶的摇瓶发酵达 1．2．2 重组质粒 的构建及转化 将 PCR扩增片段 回收 到了较高水平 。J。为了进一步提高工程菌的表达水平 后 ，用 EcoRI酶酶切 ，并 同SnaBI，EcoRI酶酶切过 的 改善其热稳定性 ，本研究通过易错 PCR介导的随机突变 pPIC3．5k载体构建成含有随机突变基 因的重组质粒 对扩展青霉碱性脂肪酶 (PEL)基因进行改造。 pPIC3．5K—lip07一mutantx。再用 saJI酶对构建好的重 1 材料和方法 组质粒进行线性化。通过 Bio—Rad电穿孑L仪的电击，在 1．1 材料 电压 1．5kV，电容 25．o／F，时间约 4ms条件下，将重组质粒 1．1．1 菌种和质粒 PichiapastorisGS115、E．coliDH5ct、 导入到毕赤酵母 GS115中。 pPIC3．5K及 lip07模板由本课题组保藏 。引物序列如下： 1．2．3 突变基因的表达、筛选 将 MD板上长出的所有 5’一TTA CGTAATGrrGIT CAA CTA CCA ATC一3’ 转化子，转接到YPOM板上培养。初步挑取YPOM板上透 3’一TGCAGGAATTCGATC TCA一5’ 明圈大小明显 比野生菌 lip07有变化的转化子 ，并将其转 以上引物由上海生物工程技术服务有限公司合成 。 接人MGY培养基，待其 0D 至 2—6时，离心收集菌体 1．1．2 酶和试剂 DNA限制性 内切酶 EcoR I、SnaB I 后 ，再次转接人 MMY培养基，并使其初始 OD鲫=1，每隔 和SalI，T4DNALigase为TaKaRa公司产品，PCR所用试 24h取样 ，用橄榄油检验板检测并添加总体积 1．5％的甲 剂为上海生物工程技术服务有限公司生产，其他化学试剂 醇诱导表达 ，约4～5d。 均为国产或进 口分析纯