荧光定量PCR技术检测PRRS变异病毒的研究.pdfVIP

试 验 研 究 荧光定量PCR技术检测PRRS变异病毒的研究 刘永飞 ，黄金海 ，梁智选 ，李秀梅 ，杨爱华 ，郭立力 (1．天津大学化工学院。天津，300072；2．天津市动物疫病预防控制中心。300402) 摘 要：为了能准确、快速的检测nsp2基因缺失的猪繁殖与呼吸系统综合征变异病毒(PRRSV)， 在nsp2基因核苷酸序列上设计了一条上游引物(nsp2-1)和两条下游引4h~(nsp2—2，nsp2—3)，其中 一 条下游引物(nsp2—2)设计在缺失碱基序列区域。通过条件优化建立了区分经典株和高致病性 nsp2基因缺失株的PCR方法；并将最优化条件运用于SYBRGreen荧光定量PCR 实验 ，建立 了根据融解曲线鉴别nsp2缺失变异株的荧光定量PCR方法，可检 出3~6个基因拷贝。 关键词：PRRSV；nsp2基因；SYBR Green荧光定量PCR D0l：10．3969／J．ISSN．1671-6027．2011．08．O18 猪繁殖与呼吸系统综合征(Porcinereproductive 引物由北京奥科生物公司合成。 andrespiratorysyndrome，PRRS)俗称 “蓝耳病”，是 1．2 方 法 一 种由猪繁殖与呼吸系统综合征病毒(PRRSV)~l起 1．2．1 引物的设计 的以母猪繁殖障碍和仔猪的呼吸道症状以及高死 运用DNAMAN软件对nsp2基因缺失株TJ—H1 亡率为特征的高度接触l生传染病。1987年该病首次 和经典株 TJ—H3的核苷酸序列进行 比对 ，结合 爆发于美国，世界各国也相继呈流行性感染，给世 GenBank数据库中其他株 PRRSV的序列特点，在 界养猪业造成了巨大的损失。 缺失部分的上游设计一条上游引物 nsp2—1，在缺失 1 材料与方法 部分和缺失部分 的下游各设计一条下游引物 1．1材 料 nsp2—2和nsp2—3。三条引物的序列如下 ：nsp2—1： 1．1．1 质粒和毒株 已克隆PRRSV高致病性毒株 CCTAA CGGTr GGGAA GAT13GACTG；nsp2—2： TJ—Hl和经典株 TJ—H3的nsp2基因的质粒由本实 CCACC TGCTG AAATT TGTGT CGC；nsp2-3：A— 验室构建 ，Genbank登录号分别为 GQ923891、 CACA GGTGC AGGGT TGATG TCATr。 GQ923892、GQ923893。猪繁殖与呼吸系统综合征病 1．2．2 PCR反应体系的优化 毒(PRRSV)抗体阳性血清 12份由天津市动物疫病 分别以TJ—H1和TJ—H3nsp2一T载体为模板，对 预防控制中心提供。 退火温度、循环次数及双重PCR反应中三条引物的最 1．1．2仪器和试剂 高速冷冻离心机购 自力康公 佳浓度配比等进行优化，确定PCR反应的最佳条件。 司 ，AppliedBiosystems7500FastReal—TimePCR 1．2-3 PCR反应特异性和敏感I生检测 仪购 自AppliedBiosystems公司。Trizol试剂购 自北 分另0以nsp2—1、nsp2—2弓I物 ，nsp2—1、nsp2—3弓I 京康为世纪生物公司，反转录酶购 自杭州博 日科技 物和nsp2—1、nsp2—2、nsp2—3引物对TJ—H1和TJ—H3 公司，TaqDNA聚合酶购 自北京全式金生物公司， 进行扩增，确定PCR反应的特异性。 分别以TJ—Hl和 TJ—H3nsp2一T载体为模板， ★通讯作者 进行 10倍梯度稀释，用 nsp2一l、nsp2—3扩增 ，确定 小鼠溶菌酶 (IS)试剂盒测定血清标本中小鼠溶菌