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骨桥蛋白反义基因在肺癌浸润与转移中的作用 　　作者：徐沛然 杨志广 赵慧敏 邵国光 作者单位：吉林大学第二医院胸外科，吉林 长春 130041 　　【摘要】 目的 探讨骨桥蛋白(OPN)反义基因对肺癌细胞增殖和浸润转移的影响。方法 (1)PCR扩增获得人OPN基因，pcDNA3.1(+)载体连接。酶切、测序。(2)脂质体介导将pcDNA3.1ANOPN基因转入ECA 109，G418筛选获得稳定表达ANOPN基因的转染细胞A54ANOPN，及表达空载体的A54vect细胞，空白对照A54。RTPCR检测mRNA。体外观察对比各组间倍增时间、黏附、侵袭及迁移能力的差异。结果 成功构建了pcDNA3.1ANOPN质粒，测序结果与GenBank中公布的序列同源性为100%。与A54vect、A54相比，A54ANOPN细胞OPN mRNA表达明显降低;倍增时间增加;黏附、侵袭及迁移能力明显降低。结论 ANOPN基因的稳定表达明显抑制肺癌细胞的恶性表型。 　　【关键词】 骨桥蛋白;肺癌;反义基因治疗 　　研究发现肺癌、结肠癌、胃癌、十二指肠癌、肝癌、胰腺癌、食管癌等多种肿瘤细胞均有骨桥蛋白(OPN)的过量表达〔1〕，动物实验和临床研究均证实OPN的过量表达与肿瘤的发生和进展密切相关。Chamber等〔2〕用Northern blot和免疫组化技术对肺癌进行分析，结果表明与各自正常的肺组织相比，大多数肿瘤过度表达OPN mRNA，在OPN染色阳性的标本，肿瘤浸润区中的巨噬细胞和坏死灶呈现染色反应，少量是肿瘤细胞，OPN染色阳性的肿瘤与病人的预后关系有统计学意义，说明肺癌中的OPN水平在临床可以作为判断病人预后的指标。国内对于构建反义OPN基因的重组质粒鲜有报道。本实验构建了反义OPN基因的重组质粒(pcDNA3.1ANOPN)，探讨其在肺癌细胞浸润与转移中的作用。 　　1 材料与方法 　　1.1 细胞、细菌菌株及质粒载体 　　真核表达载体pcDNA3.1(+)购自invitrogen公司。A54肺癌细胞株由大连宝生物公司鞠险峰馈赠。 　　1.2 反义OPN基因重组质粒pcDNA3.1ANOPN的构建 　　以GenBank公布的人OPN序列为参照，用Primer 5.0软件设引物如下：上游引物：5GCGCTCGAGCATACCAGTTAAACA3;下游引物：5GCGAAGCTTCCGGGTTAATTCCG3。cDNA为模板，用OPN引物扩增目的基因。PCR循环条件：94℃预变性5 min，94℃ 1 min，55℃ 1 min，72℃ 1 min，共35个循环，72℃后延伸10 min。琼脂糖凝胶电泳，PCR产物回收。按TaKaRa公司T载体连接试剂盒使用说明书进行目的基因的克隆及序列测定。氯化钙法制备感受态大肠杆菌，转化连接产物。转化菌质粒DNA提取使用Promega公司提取纯化试剂盒WizardTM Plus Minipreps，具体操作按使用说明书进行。 　　阳性克隆送大连宝生物公司测序，GenBank Blast等软件进行序列同源性分析。 　　用Xho I和Hind Ⅲ 双酶切重组质粒pMD18TOPN及pcDNA3.1(+)载体，回收目的片段和载体片段用T4连接酶连接，构建重组质粒pcDNA3.1ANOPN。对重组质粒用Xho I和Hind Ⅲ双酶切，送大连宝生物公司进行测序，用GenBank Blast等软件进行序列分析。 　　1.3 脂质体转染 　　细胞转染分为3组：A组为实验组，转染含pcDNA3.1ANOPN质粒者命名为A54ANOPN;B组为实验对照，转染空载体pcDNA3.1质粒者命名为A54vect;C组为空白对照，只加入等量脂质体，命名为A54;72 h后加G418筛选阳性克隆，扩增。 　　1.4 MTT比色法绘制细胞生长曲线 　　对数生长期A54ANOPN与A54vect及A54，胰酶消化，接种于96孔板，加含10%小牛血清的RPMI1640培养液。已未接种细胞的孔作空白对照，37℃，5% CO2培养箱培养。MTT比色法，参照波长630 nm，检测波长570 nm，A值代表活细胞的多少。取其A值平均值为纵轴，培养时间为横轴绘制曲线。 　　1.5 RTPCR检测OPN mRNA表达 　　Primer 5.0软件以GenBank公布的人OPN序列为参考，设计引物及内参Βactin引物如下：上游：5′AAGCCTGACCCATCTCAGAA3′;下游：5′GCAACTGGGATGACCTTGAT3′;扩增片段长度446 bp。Βac