单层细胞共培养对猪去卵丘卵母细胞体外成熟和孤雌发育的影响.pdfVIP

上海市畜牧兽医学会2011 年学术年会论文集  1 材料与方法 除特别注明外，本试验所用生化试剂均购自Sigma 公司。 1.1 共培养单层细胞的制备 1.1.1 猪卵丘颗粒细胞 pCCs 细胞按上海市农业遗传育种重点实验室方法分离后[7] ，按 0.5-1×106 cell/mL 的浓度接种至四孔板内，加入 500 μL 细胞培养液[高糖 DMEN+ 1%NEAA+ 1mmol/L Sodium-pyruvate+ 10%FBS+ 1%双抗（v/v, GIBCO,NO.15140 ）]生长至 80%汇合，期间每24 h 半量 换液。最后将细胞培养液更换为 500 μL 的成熟培养液 （TCM-199+10% pFF+10%FBS+10 IU/mL HCG+10 IU/mL PMSG+10ng/mL EGF+ O.57 mmol/L 半胱氨酸+ 1%双抗），在39 ℃，5%CO2 ，饱和 湿度培养箱内孵育4 h 以上，制备成条件化共培养体系，备用。 1.1.2 猪输卵管上皮细胞 挑选健康无病变的猪输卵管，无菌 D-PBS 中清洗 4~5 次，剪下 3 cm 输 卵管（包含输卵管壶腹部）。将输卵管一头结扎，注入 0.25% Trypsinase, 0.02% EDTA 至输卵管饱 满，结扎另一侧输卵管，置于 D-PBS 内。4 ℃下消化过夜。次日，轻轻挤出输卵管内消化液，血 清终止消化。以 D-Hank’s ，800×g 清洗细胞 3~4 次，最后一次以细胞培养液重悬为细胞悬液，按 0.5×106~1×106 cell/mL 接种至四孔板内生长至 80 ％汇合，期间每 24 h 半量换液。最后将细胞培养 液更换为 500 μL 的成熟培养液，在39 ℃，5%CO2 ，饱和湿度培养箱内孵育4 h 以上，制备成条 件化共培养体系，备用。 1.1.3 猪卵巢皮质细胞 卵巢采集后，修剪除去卵巢上的脂肪与韧带组织。将卵巢皮质剥离并剪碎， 镜下去除剩余的卵巢髓质与可见小卵泡。随后将卵巢皮质仔细剪成 1 mm3 左右的碎块。将碎块间隔 2~3 mm 均匀铺与细胞培养瓶底部，然后加入少量细胞培养液翻转放置4 h 后，补足细胞培养液后正 置培养瓶进行原代培养。至细胞爬出后，将原代pOCCs 用0.1%胰蛋白酶消化5 min，终止消化后， 将消化物过 100 目细胞筛，750×g 下 4 min 离心重悬 3~4 次。最后一次以细胞培养液重悬为细胞 悬液，按 0.5×106~1×106 cell/mL 接种至四孔板内生长至 80%汇合，期间每24 h 半量换液。之后将 细胞培养液更换为 500 μL 的基础成熟培养液，在39 ℃，5%CO2 ，饱和湿度培养箱内孵育4 h 以上， 制备成条件化共培养体系，备用。 1.2 卵母细胞的采集，Dos 的获得和体外成熟 1.2.1 去卵丘卵母细胞的采集 卵巢采集于上海长宁区复兴屠宰场，按上海市农业遗传育种重点实 验室方法进行[8] 。采集的卵丘卵母细胞复合体(cumulus-oocyte, COCs)用 TL-HEPES-PVA （含0.1% PVA 的TL-HEPES ）清洗后，再将COCs 置于含0.1%透明质酸酶的TL-HEPES-PVA 中反复吹吸去 除卵丘细胞。 1.2.2 Dos 的单层细胞共培养体外成熟 将Dos 放入预先准备好的条件化共培养体系中，放入39 ℃， 5% CO2 ，饱和湿度培养箱内培养44 h 。 1.3 卵母细胞 M Ⅱ期的判定 将成熟后的无卵丘卵母细胞分别用以下三种方法进行成熟判定。在体 视镜下反复翻转IVM 后卵母细胞。以排出第一极体（PbI ）的卵母细胞，认定其达到M Ⅱ期；将IVM [9] 后的卵母细胞用Oosight imaging system 进行判定，Oosight imaging system 使用方法见参考文献 ，