急性多发脑梗缺血海马、皮层MARCKS磷酸化及其基因表达的动态变化及清脑滴丸干预作用.pdfVIP

314 中风病·实验研究 本研究采用改良Kaneko法制作多发性脑梗塞动物模型，观察造模后大鼠的神经系统症状 体征积分改变，光镜下脑组织的病理变化及透射电子显微镜下细胞超微结构的改变，同时应 用RT—PCR法和westernblot法检测MARCKS蛋白及其磷酸化在大鼠脑组织海马和皮层部位的 表达，并用清脑滴丸进行干预，从蛋白、基因水平对中药的缺血保护作用机制探索新的实验 依据，为中药临床治疗缺血性中风及血管性痴呆提供客观科学的依据。 1材料 1．1动物 健康雄性清洁级SD大鼠165只，体重2004-lOg，由北京维通利华实验动物技术有限公 司提供，许可证号：SCXK(京)20027-0003。 1．2主要药品与试剂 aCro Cruz p-MARCKS、Donkey kDa) (北京赛百盛基因技术有限公司)；NC膜(Millipore公司)；丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、 试剂盒(Promega)。 1．3主要仪器 垂直电泳仪、半干转移槽(Amersham PCR仪(Eppendorf)；水平电泳仪(北京市六一仪器厂)。 2方法 2．1急性多发脑梗死大鼠模型制备 采用同种系体外微栓子注入法制备急性多发脑梗死大鼠模型，同种Wistar大鼠左心室 内采血，于80C温箱内干燥4h，研碎后用200um筛孔过筛，应用时取血栓栓子lmg加生理 盐水制成29／L的栓子混悬液。大鼠以10％水合氯醛按0．35mL／lOOg体重腹腔注射麻醉，颈 正中切开皮肤，剥离肌群，暴露右侧颈总动脉、右侧颈外动脉与右侧颈内动脉，暂时夹闭右 侧颈总动脉，于右侧颈外动脉逆行插管注入栓子溶液0．3mL，推注同时开放右侧颈总动脉， 使栓子通过右侧颈内动脉进入颅内至人脑各动脉，然后结扎右侧颈外动脉，缝合皮肤。 2．2分组 实验一随机分为7组，正常组、假手术组、模型lh组、模型6h组、模型24h组、模型72h 组、模型7d组，每组15只大鼠。 实验二随机分为4组，正常组、假手术组、模型组、中药组，每组15只大鼠。 2．3脏染色 各组大鼠随机抽取3只，使用4％多聚甲醛经心脏灌流固定，断头取脑放入4％多聚甲醛 溶液中外固定。随后行石蜡包埋，制成5um厚度的同一冠状面石蜡切片，常规脱蜡水化处理 2010年国家中医药管理局脑病重点研究室建设研讨会暨中风病科研成果推广交流会论文汇编 315 后，HE染色。 2．4western blot检测海马、皮层MARCKS及p-MARCKS蛋白表达 2．4．1组织总蛋白的提取 大鼠断头、取脑(整个过程应在5min之内完成)，取患侧海马、额叶皮层组织置入匀浆 l。将 20min。离心后取上清液，即得组织总蛋白溶解液，应用蛋白测定试剂盒对溶解液中蛋白含 量进行测定，分装后在一80℃条件下保存。 2．4．2蛋白质浓度测定 2．4．3SDS电泳 安装电泳装置和配制凝胶溶液，蛋白质电泳样品的准备，转膜，杂交，显影，光密度扫 描。 2．5RT-PCR法对海马、皮层MARcl(SmRNA的动态表达 大鼠海马与皮层组织总RNA提取，R卜PCR引物设计，RT-PCR反应。 2．6统计方法 数据结果以X±s表示，用SPSS13．0统计软件包行单冈素方差分析(0ne—wayANOVA)， 以PO．05为差异有统计学意义。 3结果 3．1大鼠神经功能缺损评分 评分标准采用Bederson评分标准，每日评分2次(用恫吓方式查看大鼠反应和活动能 力)。正常组、假手术组、模型24h组、72h组、7d组大鼠，在造模后24h同一时点进行神 经功能缺损评分，3组评分平均分分别为2．18、2．12、2．41(平均为2．24)，表明造模后24 小时，大鼠出现明显神经功能缺损。 3．2组织形态学及超微结构改变 光镜组织形态学改变：正常组海马、皮层神经细胞核膜清晰、核仁明显，神经细胞数目 多，呈多层排列，且紧密整齐，神经细胞结构和分布正常，未见软化灶。假手术组