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采用混合模式色谱与电雾式检测器测定蛋白药物中的聚山梨醇酯20 郑萍1刘绿叶2张艳海2金燕2 1.四川省成都市食品药品检测中心，成都6100452.赛默飞世尔科技中国有限公司，上海201203 摘要 目的:建立混合模式色谱和电雾式检测器测定蛋白药物中的聚山梨醇酯20的含量。方法:色谱柱为OasisMAX(2.1 mm×20mm，30μm)；柱温:30℃；流动相A:2％ （体积分数）甲酸的异丙醇溶液，流动相B:2％ （体积分数）甲酸的水溶液，梯 度洗脱；进样体积30 μL;电雾式检测器，雾化室温度:30℃，采样频率:5Hz。结果:聚山梨醇酯20的峰面积与含量线性回归 方程为Y=6.6429X-0.0445，相关系数(r)为0.9994，线性范围为9.4～ 188.0μg·mL-1;峰面积和保留时间RSD值分别为 0.66％和0.04％；平均回收率分别为98.29％；方法定量限 （以信噪比S/N=10计）为1.1μg·mL-1。结论:该方法重现性较 好，样品检出限低，可作为药物及制剂中聚山梨醇酯20的含量测定方法。 关键词:混合模式色谱；电雾式检测器；聚山梨醇酯20；蛋白药物 生化、抗生素药品 4结果与讨论 4．1色谱条件 4．1．1色谱柱选择聚山梨醇酯20是一类强亲水性化合物，在ODS柱上保留较弱，因此可能与其他辅料 He— 如甘露糖、Tfis等不能进行很好的分离，因而影响对聚山梨醇酯20进行准确的定量分析。因此，Daniel SB witt等(131采用了Zorbax 模式¨23分析聚山梨醇酯20，由于HILIC模式对亲水性化合物的分辨度较高，随着碳数的增加，依次出现多个 峰，因此影响了整体定量，且普通的120A孔径的硅胶基质HILIC柱不能兼容大分子的蛋白分析。因此，M． 500 Huang等114】尝试采用了Biotrap 抗中的甲氨蝶呤，取得了较好的效果，蛋白能与色谱填料表面的亲水层产生排斥作用，从硅胶颗粒表面洗脱 出去，同时，小分子化合物能进入颗粒物内部，与其中的键合相产生分配吸附作用，最终对目标化合物进行分 离，但在DanielHewitt等采用此色谱柱对单克隆抗体的分析时，却出现了蛋白干扰。因此，本文参照了Dan— iel Hewitt的实验报道，采用了OasisMAX色谱柱，其由亲脂性二乙烯苯和亲水性N一乙烯基吡咯烷酮两种单 体按一定比例聚合成的大孔共聚物填料【l如[图2(图略)]，粒径较大(大于30斗m)，不会被蛋白阻塞，同时， 聚合物基质进行了亲水官能团(吡咯烷酮)的处理，避免了蛋白的死吸附，不会受到蛋白的强烈干扰。该色 谱柱填料颗粒孔内同时键合了阴离子交换官能团(季铵盐)，因此整个色谱柱不但具有阴离子交换功能，同 时又具有反相分离功能，能共同作用对聚山梨醇酯加产生保留。 4．1．2流动相选择分别采用异丙醇、甲醇、乙腈作为有机相进行洗脱试验，由于甲醇会导致峰分裂，聚山 梨醇酯20不会洗脱成1个整体峰，影响定量，因此采用了异丙醇作为有机相。本文还尝试采用乙腈洗脱，从 结果来看(数据未给出)，相同浓度的峰高响应值及峰形均与异丙醇分析得出的结果相似，但考虑到聚山梨 醇酯20在乙腈中的溶解度，以及过高的乙腈会导致蛋白变性，最终放弃了把乙腈作为有机相。通过质谱检 测结果¨刚发现，在异丙醇少于20％时，死体积处的峰中含有少量未与脂肪酸键合的聚乙氧基山梨糖醇[图3 中1号峰(图略)]。当异丙醇含量高于25％时，聚山梨醇酯20会洗脱成1个单峰。另外，整个流动相调节 至低pH值，主要是为了让蛋白和其他赋形剂带上正电荷，与MAX色谱柱产生离子排斥作用，在死体积出 峰；同时，让乙酸等酸性化合物变成中性分子化，不能与色谱柱发生离子交换，较快的从色谱柱中洗脱出来， 不会干扰到聚山梨醇酯20的出峰位置。 4．1．3检测器选择及条件优化分别考虑了采用示差折光检测器、蒸发光散射检测器与电雾式检测器进行 定量检测分析。在示差折光检测器中，只能采用等度洗脱，分析时间很长，灵敏度较低。采用蒸发光散射检 测器分析时，Daniel 采用阀切换技术才解决了这个问题。因此，本文为了避免以上问题，采用了电雾式检测器作为检测工具，参 C等¨71和CraftsC等¨引的文献