大鼠骨髓间充质干细胞钾通道电生理特征.pdfVIP

大鼠骨髓间充质干细胞钾通道电生理特征 王韶屏王建安骆荣华 浙江大学医学院附属第二医院心内科(310009) 钾离子通道是细胞膜中种类最为繁多的一类离子通道，广泛分布于多种组织／细胞中，其中包括 可兴奋细胞(如：心肌细胞、血管平滑肌细胞、胰腺13细胞等)和非可兴奋细胞(如：血管内皮细胞、 淋巴细胞等)。钾通道在不同细胞(组织特异性)以及同一细胞的不同功能和病理生理状态下的差异 性表达，对于调控细胞功能起着至关重要的作用。因为不同的钾电流，同一钾电流不同的电生理状态 决定和影响细胞的静息膜电位，复极化的频率，细胞内渗透压，细胞的迁移、分化、增殖和死亡。心 均是钾通道表达和功能的异常导致的心肌复极异常所致。心房颤动、心肌梗死、心力衰竭均有钾离子 通道电重构的参与。肺动脉高压伴随有钾通道电流密度降低导致的血管平滑肌细胞凋亡不足，肺小动 脉血管重塑。非可兴奋的肿瘤细胞中，某些特异性的钾通道可望成为肿瘤治疗药物新靶标，诊断和预 后的生物标记物。 骨髓米源的间充质干细胞可以通过细胞分化和／融合，旁分泌多种具有抗细胞凋亡和心室重塑等 功能的细胞因子，影响心肌干细胞生存微环境等多种途径来改善心肌梗死后心功能的恢复。如何在体 外调控干细胞的定向分化，促进细胞的增生，减少细胞移植后干细胞的凋亡是于细胞再生医学的一个 重要研究方向。上述干细胞生物学行为的变化和钾离子通道功能密不可分。然而，有关骨髓干细胞离 子通道的研究很少。本文就大鼠骨髓间充质干细胞钾离子通道的电生理特征作一初步研究。 材料和方法 1．主要液体的配制 台氏液：136mM氯化钠，5．4mM氯化钾，2．8mM氯化镁，O．33mM磷酸二氢钠，10Mm葡萄 10mMHEPES(用氢氧化钠将PH调至7．4)。电极内液：20mM氯化钾，110mM天冬安酸 糖，and mMHEPES，0．05mMEGTA，0．1mMGTP，5．0mM磷酸肌酸钠，5．0mM 钾，1．0mM氯化镁，10 M92．ATP(用氢氧化钾将PH调至7．2)。 2．细胞培养 中，用淋巴细胞分离液密度梯度离心法分离出单个核细胞。用DMEM洗2次后在25cm2组织培养瓶 EGTA消化，以1：3传代。取3-6代细胞进行电生理记录。 257 3．全细胞钳制记录 将细胞消化至灌流槽中，培养箱中静置约15分钟，待细胞贴壁后转移到倒置显微镜工作台，用台 并接触细胞膜表面，负压吸引形成高阻封接(lG)，再施以微小负压破膜。液接电位在电极接触细 胞前予以补偿，系统电阻常规补偿至75～90％。电流信号通过Axopatch200B膜片钳放大器，数模转 换器和pClamp9．2膜片钳软件分析系统记录分析。室温(21～22C)实验。 4．反转录聚合酶链反应 在25pl的反应体系中反转录成cDNA，作为PCR的底物。 dNTP MgCl21．5pl，2．5mM 电泳，溴化乙锭染色，成像分析。 5．统计分析 l 6．1软件进行非线形曲线拟合，计量资料以“均数±标准差”表示。SPSS1．0软件， 采用Origin 对两组数据行配对或独立样本的t检验，以PO．05为显著性差异。 结果 1．干细胞的鉴定 密度梯度离心所得细胞为比较一致的球形单个核细胞，培养24dx时，大部分细胞贴壁，呈集落式生K， 扩大并相互融合，约7~lO天铺满瓶底。大部分漂浮不贴壁细胞随换液去除。多次传代后，细胞均匀 有序的呈成纤维细胞样分布。第3代细胞经流式细胞仪鉴定干细胞特异性表面标志物阳性：CD90 2．全细胞电流特点 电压钳制时间为180ms。全细胞记录所得的MSCs钾电流表现为多种形态特点。最常见的为延迟整流 另一成分在+40mV至U+60mV中快速激活，电流表现为噪声样的振荡，类似于电压和钙激活钾电流 (IKc。)。图lc表现为瞬时外向钾电流(I协)，快速激活后伴有明显的失活，并含有噪声样的IKc。成分。 还有少部分细胞尽管记录过程中的漏电流很低而且封接电阻很高，但在．60mV至lJ+60mV的去极化过 程中没有记录到外向钾电流(I200pA)，如图】D。 258 图l 干细胞全细胞电流