艾灸“足三里”对亚急性衰老小鼠DNA影响的实验研究.pdfVIP

（1）实验动物：健康 ICR 小鼠36只，雄性，2月龄，体重(30±3)g，由维通利华 提供。 （2 ）艾条：中国南阳市卧龙汉医艾绒厂生产的“天然华佗念盈艾条” （型号： mg—454 ），规格：18×200mm。 （3 ）仪器与试剂：RF25301PC 荧光分光光度计( 日本岛津公司) ，MICRO24杂交 炉(英国 Hy2baid 公司) ，全自动凝胶成像系统(美国思博明科学器材公司) ； DNA 提取试剂盒(美国 Promega 公司) ，端粒长度测定试剂盒（德国Roche 公司），D- 半乳糖（上海试剂二厂），0.9%NaCl 注射液（北京双鹤药业）。 1.2 方法 （1）分组：小鼠适应性饲养3d,称重后小鼠编号，按照随机化数字表分为3组:空 白组、衰老模型组、衰老模型加艾灸治疗组（艾灸治疗组），每组12只。 （2 ）造模：衰老模型组、艾灸治疗组小鼠每日背部皮下注射10mg/ml 的D-半乳 糖溶液100mg/kg[4-5] 以制造亚急性衰老模型，空白组小鼠每日背部皮下注射等量 生理盐水作为对照，连续30d 。 [6] （3 ）穴位定位：参考林文注主编《实验针灸学》 常用动物穴位定位法及拟人 对照法定位。“足三里”穴：膝关节外侧，腓骨小头下3.5mm 处。 （4 ）艾灸方法：将艾灸治疗组小鼠双侧足三里穴区剃毛，持艾条于单侧足三里 穴上方0.5cm 处温和灸( 以小鼠相对安静，无剧烈挣扎、嘶叫为度) ，每次7min， [7] 隔日1次，左右交替，共灸15次 ，灸时室内无风。经预实验皮温测试，艾灸3min 达到最高温度约44 ℃，之后维持在43.5 ℃左右。 （5 ）实验步骤：所有小鼠分组处理：空白组每日注射生理盐水，衰老模型组及 艾灸治疗组每日注射 D-半乳糖，同时艾灸治疗组隔日固定进行艾灸，模型组给 予相应固定处理，不艾灸。各组均正常饲养，于第30d 最后一次艾灸后12h 进行 跳台试验，记录各组小鼠潜伏期（第一次跳下跳台至返回跳台的时间）及错误次 数（返回后又跳下跳台的次数），24h 后重新测定并再次记录，通过比较两次数 据评价小鼠的记忆力。 （6 ）采集标本：跳台试验结束后将所有小鼠称重并脱颈椎处死，迅速取脾用于 测量脾指数，取脑组织用液氮冻存（ [8] -80℃）备用，用于测定端粒长度 。 （7 ）端粒长度检测：按DNA 提取试剂盒说明操作，提取小鼠脑组织 DNA, 4 ℃ 344 保存。按端粒长度检测试剂盒说明，将各组 DNA 样品经内切酶(Hinf Ⅰ和 Rsa Ⅰ) 消化后，进行0.8% 的琼脂糖凝胶电泳，转膜，与探针杂交，洗膜，与显色液反应， 放入 X 线片盒中，暗室显影、定影。将带有 DNA 条带的 X 光片置于美国 GENEGEN IUS 型全自动凝胶成像系统中，用 Gene Tools 软件进行扫描，用 [9] Quantityone 软件计算端粒(TRF)长度 。计算公式：TRF=Σ(ODi)/Σ(ODi/Li) （ODi 表示位置 i 的化学发光信号值,Li 表示位置 i 的TRF 片段长度）。 1.3 统计学分析 _ 数据用x s 表示。所有数据使用 SPSS 17.0软件进行处理，所用统计方法为方 差分析。 2 结果 2.1 跳台试验成绩 与衰老模型组及空白组相比，艾灸治疗组小鼠记忆力明显较好，数据无统计 学差异（P0.05 ）。采用GLM 过程进行分析以观察各组31 日与30 日成绩提高幅 度，从而评价其记忆力:各组潜伏期31 日均较30 日缩短，其中艾灸组缩短幅度明 显，且平均潜伏期最短，模型组与空白组差距不大；各组错误次数31 日均较30 日减少，其中艾灸组减少幅度最大，空白组次之，模型组为末，平均错误次数艾 灸组