093.高效液相色谱法检验操作规程.docVIP

赣州亿圆生物药业有限公司 操作标准----设备管理 文件名称 高效液相色谱法检验操作规程 编 码 SOP-SB-00-093 页 数 5—1 实施日期 制 订 人 审 核 人 批准人 制订日期 审核日期 批准日期 制订部门 工程部 分发部门 质管部 目 的：建立健全高效液相色谱法操作规程，使操作规程规范化。 适用范围：适用于本公司检品高效液相色谱法的检测。 责 任：质管部、QC人员。 内 容： 1、引用标准 《中华人民共和国兽药典》（二○○五年版一部）。 2、 仪器的组成和一般要求： 2.1.仪器的组成：高压输液泵；色谱柱；检测器；积分仪；打印机。 2.2.对仪器的一般要求： 2.2.1.所用的仪器为高效液相色谱仪。色谱柱的填充剂和流动相的组分应按各品种项下 的规定使用。常用的色谱柱填充剂有硅胶和化学健合硅胶，后者以十八烷基硅烷键合硅胶最为常用，辛基硅烷键合硅胶次之，氰基或氨基键合硅胶也有使用。离子交换填充剂用于离子交换色谱；凝胶或玻璃微球等填充剂用于分子排阻色谱等。除另有规定外，柱温为室温，检测器为紫外吸收检测器。 2.2.2.在用紫外吸收检测器时，所用流动相应符合紫外分光光度法项下对溶剂的要求。 2.2.3.正文中各品种项下规定的条件除固定相种类、流动相组分、检测器类型不得任意 改变外，其余如色谱柱内径、长度、固定相牌号、载体粒度、流动相流速、混合流动相各组分的比例、柱温、进样量、检测器的灵敏度等，均可适当改变，以适应具体品种并达到系统适用性试验的要求。一般色谱图约在20分钟内记录完毕。 2.2.4.紫外分光光度法项下对溶剂的要求：用1cm石英吸收池盛溶剂，以空气为空白（即 空白光路中不置任何物质），测定其吸收度。溶剂和吸收池的吸收度，在220～240nm范围内不得超过0.40，在241～250nm范围内不得超过0.20，在251～300nm范围内不得 超过0.10，在300nm以上时不得超过0.05。 3、系统适用性试验： 赣州亿圆生物药业有限公司 操作标准----设备管理 文件名称 高效液相色谱法检验操作规程 编 码 SOP-SB-00-093 页 数 5—2 按各品种项下要求对仪器进行适用性试验，即用规定的对照品对仪器进行试验和调整，应达到规定的要求，或规定分析状态下色谱柱的最小理论板数、分离度、重复性和拖尾因子。 3.1.色谱柱的理论板数（n）在选定的条件下，注入供试品溶液或品种项下规定的内标 物质溶液，记录色谱图，量出供试品主要成分或内标物质峰的保留时间tR（以分钟或长度计，下同，但应取相同单位）和半峰高宽（Wh/2），按n=5.54(tRWh/2)2计算色谱柱的理论板数。如果测得理论板数低于各品种项下规定的最小理论板数，应改变色谱柱的某些条件（如柱长、载体性能、色谱柱允填的优劣等），使理论板数达到要求。 3.2.分离度 定量分析时，为便于准确测量，要求定量峰与其他缝或标峰或内标峰之间 有较好的分离度。分离度（R）的计算公式为： R = 式中：tR2为相邻两峰中后一峰的保留时间； tR1为相邻两峰中前一峰的保留时间； W1及W2为此相邻两峰的峰宽。 除另有规定外，分离度应大于1.5。 3.3.重复性 取各品种项下的对照溶液，连续进样5 次，除另有规定外，基峰面积测量值的相对标准偏差应不大于2.0%。也可按各品种校正因子测定项下，配制相当于80%、100%和120%的对照品溶液，加入规定量的内标溶液，配成3种不同浓度 的溶液，分别进样3次，计算平均校正因子，其相对标准偏差也应不大于2.0%。 3.4.拖尾因子 为保证测量精度，特别当采用峰高法测量时，应检查特测峰的拖尾因子 （T）是否符合各品种项下的规定，或不同浓度进样 的校正因子误差是否符合要求。拖尾因子计算公 赣州亿圆生物药业有限公司 操作标准----设备管理 文件名称 高效液相色谱法检验操作规程 编 码 SOP-SB-00-093 页 数 5—3 式为： T = 式中：W0.05h为0.05峰高处的峰宽； d1为峰极大至前沿之间的距离。 除另有规定外，T应在0.95～1.05之间。 4、操作方法： 定量测定时，可根据供试品的具体情况采用峰面积法或 峰高法。测定杂质含量时，须采用峰面积法。 4.1.外标法测定供试品中某个杂质或主要成分含量。 按各品种项下的规定，精密称（量）取对照品的供试品，配制成溶液，分别精密取一定量，注入仪器，记录色谱图，测量对照品和供试品待测成分的峰面积（或峰高），按下式计算含量：