中药对骨髓间充质干细胞免疫调节作用干预实验研究.pdfVIP

中药对骨髓问充质干细胞免疫调节作用干预的实验研究 摘 要 研究背景 disease，AID)属于难治性疾病，严重危害着人类健 自身免疫病(Autoimmunity 康，目前尚无满意的治疗药物。长期以来，现代医学实施的标准治疗是激素非特异性 免疫抑制疗法，疗效虽己被证实，但只能改善症状，不能有效地从根本上控制疾病的 发生和发展，且毒性、副作用大，不能长期持续应用。故急需寻找开发高效、低毒乃 至无毒的免疫调节药物。中医药学的临床实践表明，大量天然药物及其植物来源的单 体或有效部位对自身免疫病具有一定的预防、治疗作用，中药免疫调节剂应用具有毒 副作用小、疗效好等特点，日益广泛地应用于临床，因而成为自身免疫病药物开发的 一个新领域。 iTlarro．,v stem 骨髓间充质干细胞(bone mesenchymalceils，MSCs)是一种存在于 骨髓中的非造血干细胞，具有自我更新、高度增殖及多向分化的能力。研究发现MSCs 除具有支持造血，促进体内造血功能重建外，在骨髓移植中还具有抑制移植物抗宿主 病(graft．versus—host MSCs免疫调节作用的机理，目前认为主要与其抑制T淋巴细胞对刺激的反应性有关。 因MSCs具有免疫调节的功能，故在治疗自身免疫病和诱导移植耐受中有着广泛的应 用前景。自体或异体骨髓移植已经证实在治疗自身免疫病中有确切的疗效，骨髓干细 胞移植己成为治疗风湿性关节炎等自身免疫病的一种新的思路。 中医疗法强调通过调动或调整机体的内在机制(自稳调节机制)以恢复机体自我 调节能力。因此研究中药对MSCs免疫调节作用的影响，维护机体内源性正常的免疫 调节行为，可能是中医药免疫调节作用研究的一个理想的模型。本文通过观察中药对 MSCs免疫调节作用的干预的实验研究，探索中药免疫调节作用的机理，合理评价中 药的免疫调节作用。 研究方法及结果 其作用的可能机理。在此基础上，观察中药有效部位或单体对rMSCs抑制淋巴细胞 增殖作用的影响，借此研究中药免疫调节作用的可能机理。 1、rMSCs的体外分离、培养和鉴定 以SD大鼠为供体，股骨、胫骨离断，自骨髓腔内获取骨髓标本，采用直接贴壁 法培养，原代细胞以L—DMEM培养液培养传代细胞以条件培养液培养。对rMSCs生 物学特性进行研究，并采用诱导分化、免疫细胞化学方法对其进行鉴定。在本实验的 体外培养条件下，rMSCs经历了生长缓滞期、对数生长期和平台期。传代后细胞生长 速度明显增快，原代培养需要8～10d，而传代细胞仅需要4～6d即可再次传代。传5 代后，MSCs数可增加至l×108个以上。从贴壁时间的测定实验中发现，传代后细胞能 在较短的时间内贴壁，10h贴壁率达到95％以上，其接种成活率高，所以实现体外大 量扩增rMSCs是可能的，本实验建立了一种简单、有效、经济、实用的分离rMSCs的 体外培养方法。 确定 巴细胞接种密度，用于后续实验研究。结果表明淋巴细胞接种浓度为6×106个／ml， 效果最好。在后续实验中，采用该浓度的淋巴细胞以及上述刺激剂的刺激浓度进行实 验。 3、rMSC对异体淋巴细胞增殖的抑制作用 rMSCs以不同密度接种于细胞培养板，将大鼠脾脏或外周血淋巴细胞接种于 细胞增殖抑制率，观察rMSCs对淋巴细胞增殖的抑制作用。在实验中，同时观察MSCs 不同浓度培养上清液对淋巴细胞增殖的抑制作用。 淋巴细胞活化增殖均有不同程度的抑制作用，其抑制作用强度与rMSCs的数量成正 相关，而对LPS引起的淋巴细胞增殖无抑制作用。不同浓度的rMSCs培养上清液对 PHA、PMA及ConA引起的淋巴细胞活化增殖也有一定程度的抑制作用，且与其浓 度亦呈现一定的正相关关系。 4、中药对rMSC抑制淋巴细胞增殖作用的干预 或ConA刺激剂，继续培养72h后，测定淋巴细胞增殖抑制率，观察经不同中药预处 理后的rMSCs对淋巴细胞增殖抑制作用是否发生改变。 所选中药中，部分对rMSCs的免疫抑制作用确有影响，经预处理的rMSCs，对 淋巴细胞的增殖抑制影响发生一定程度的改变。其中黄芪甲苷处理后的rMSCs及其 II 培养上清液，对rMSCs抑制淋巴细胞增殖作用有一定程度减弱作用；而槲皮素、姜 黄素、Q．c处理后的rMS