中性纤维素酶葡萄糖苷酶基因的克隆表达及酶活测定.pdfVIP

·学术论坛· 数字技术与应用 中性纤维素酶β-葡萄糖苷酶基因的克隆表达及酶活测定 1 2 3 薛宇峰 吴金玲 丁悦 （1. 辽宁农业展览馆 沈阳 1 10 8 6 6 ； 2 .沈阳农业大学 沈阳 1 10 8 6 6 ； 3 .沈阳农业大学 沈阳 1 10 8 6 6 ） [摘 要]本实验以一株产胞外中性纤维素酶的菌株芽孢杆菌CY 110 为研究对象，以麸皮为诱导物发酵获得了纤维素酶的限速酶组 分—β- 葡萄糖苷酶，酶的总活力和比活力分别达到了 1056 8U 和 557 .4U/m g ，将产物分离纯化后经 SD S- 聚丙烯酰胺凝胶电泳检 测，在4 3kD a 处得到了单一条带。利用RT -PCR 方法从芽孢杆菌CY 110 中克隆出β- 葡萄糖苷酶基因，将此目的基因连接到p B S- T 载体后导入大肠杆菌DH 5 α，测序得到的阳性克隆以载体pET-2 8a 为表达质粒构建出重组质粒并转化到表达菌株BL2 1 （DE3 ）中。 IPTG 诱导表达外源基因后测定酶活并对比原始发酵酶活。结果显示：目的基因大小为139 8bp ，该序列与GenB ank 中的β- 葡萄糖 苷酶基因ABQL0 1000004 . 1 序列相比同源性达到99% ，氨基酸序列同源性达到9 8% ，将产物与p ET-2 8a 表达载体连接，经双酶切检 验，证明原核表达载体构建成功。诱导表达后的β- 葡萄糖苷酶比活力为370 .2 1U/ mg ，高于原始发酵产生的β- 葡萄糖苷酶比活 力8% 。 [ 关键词] β- 葡萄糖苷酶 诱导酶 酶活 克隆 表达 [ 中图分类号] T Q 9 2 5 [文献标识码]A [文章编号] 10 0 7 - 9 4 16 （2 0 10 ）0 5 - 0 17 3 - 0 2 纤维素酶是一组复杂酶系的总称，又 化工原料，对维持人类社会的可持续发展 药）。 称纤维素酶系，包括：外切葡聚糖酶、内 具有非常重要的意义。 1.3方法 切葡聚糖酶以及β - 葡萄糖苷酶。纤维二 1材料与方法 1.3 . 1 菌种活化及酶活测定 糖是纤维素分子的结构单元，也是纤维素 1.1菌种 种子培养基：酵母膏5g 、蛋白胨 10g 、 酶水解纤维素时的主要产物，它能强烈抑 芽孢杆菌CY 110 本室保存；大肠杆菌 H2 O 1000m L 、p H 调至7 。原始发酵培养 制纤维素酶的水解作用。β- 葡萄糖苷酶 DH 5 α；克隆载体p SB-T ；表达载体p ET- 基：蛋白胨5g 、M g SO4 0 .2 g 、KH2 P O4 能够水解纤维二糖产生两分子的葡萄糖， 2 8a 5g 、N aCl 1.2 5g 、H O 1000m l 、p H 调至 2 是纤维素酶的限速酶。它不仅可水解纤维 1.2培养基与主要试剂 7 。诱导发酵培养基：配制方法同上，另加 二糖，更可解除纤维二糖对内切葡聚糖酶 N ，N - 亚甲基双丙烯酰胺，，考马斯 入诱导物麸皮 7 .5g 。 和外切葡聚糖酶的抑制，提高水解速率和 亮蓝 R -2 5 0 （挺进基准化学试剂有限公 将4 ℃保存的菌种接种到种子培养基 程度。到目前为止，已有上百个微生物、植 司），酵母膏，蛋白胨，硫酸铵，溴酚兰等