蓝塘猪骨骼肌组织全长cDNA文库的构建.pdfVIP

Animal Bulletin Biotechnology 蓝塘猪骨骼肌组织全长cDNA文库的构建+ 蔡更元L2，陈瑶生k，王种1，李加琪17彭国良2刘糊惯2 (1．华南农业大学动物科学学院，广州510640；2．广东省农科院畜牧研究所，广州，510640) mechanismat5’endofmRN^transcripts)技 摘要：撕究运用SMART(switching x10。，重组克隆 术成功构建了蓝塘猪背最长肌组织的非均一化eDNA文库。文库容量达到1．62 比例为95．04％，片段集中分布在0．5--2．0kb之间，全长eDNA比例达到了68．o％，文库质量较高， 可用于下一步的EST测序和全长基因筛选。该文库的成功构建为绘制骨骼肌组织转录图谱，揭 示蓝塘猪优良性状的遗传基础，寻找肉用性状候选基因奠定了基础。 关键词-蓝塘猪；骨骼肌；eDNA文库；表达序列标签；SMART 蓝塘猪是我国南方著名地方品种，具有皮薄肉嫩、风味鲜美、早熟易肥的特点“1。在瘦肉型猪肉质 的遗传改良越来越受到关注的形势下，蓝塘猪成为揭示肉质性状内在遗传机制的优良素材。猪骨骼肌中 表达的基因在决定肌肉生长和肉质中起着重要作用，因而要深入了解影响这些性状的遗传园子，首先必 须对该组织中表达的基因进行分离和定性”1。通过构建高质量的eDNA文库和EST测序可以得到大量正 在表达的遗传信息，绘制基因表达骨架图和分离功能基因，因此，EST研究已成为猪功能基因组学的重 要组成部分““。本课题组运用SMART技术构建了蓝塘猪背最长肌组织的全长cDNA文库，并初步开展了 EST测序工作，为下一步构建猪骨骼肌组织转录图谱和分离重要经济性状相关基因创造了条件。直接从 mIWNA／eDNA着手分析基因的表达情况，突破了DNA水平上研究基因的传统方法，可以达到大规模、高通 量和针对性强的目的。 l材料与方法 I．I实验材料 本实验所用雄性纯种蓝塘成年猪来自广东省板岭原种猪场，取背最长肌组织样品，立即置液氮中冷 冻，转入．80(2超低温冰箱贮存备用。 1．2主要试剂 TRlzol Systems(Prom。ga eDNA Construclion 公司)，SMARTLibrary Kit(Clontcch公司)，Maxplax^PackagingExtract(Epicentre 公司)，其它试剂购白北京鼎国或广州宝泰克公司。 1．3总RNA提取，mRNA分离与鲍化 本实验采用TRIzol试剂提取总RNA，经琼脂糖凝胶电泳检测和用核酸浓度测定仪测定浓度和纯度 后，确认总RNA质量完好。采用微磁粒吸附法从总RNA中分离mRNA，测定mRNA的浓度和纯度。 1．4eDNA文库的构建 7 取高质量的mRNA约1u PCR g，以CDSIIY3 2 Mix的作用下台成cDNA第二链。经蛋白酶K处理后和纯化后，用s丘 Polymcrasc ’作者简舟：蔡更元(1970■，男．硕士．讲师。主要从事猪遗传育种研究。 ·‘积作者 第十次全国畜禽遗传标记研讨会论文集 I限制酶切割，再以CHROMO SPIN-400进行柱层析去除400bp以下的引物和小片段。然后将酶切后的 装，重组噬菌体形式的原始文库即构建完毕。 1．5 eDNA文库的质剌漩 取适量重组噬菌体感染E 估计文库的滴度。用常规的IPTG和X-Gal蓝白斑筛选方法测定重组克隆的比例。随机挑取50个分界良 coliBM258，^ 好的阳性噬菌斑，采用PCR法鉴定插入片段大小。再随机挑取25个阳