七年制碱性磷酸酶的动力学分析.ppt

碱性磷酸酶的动力学分析 酶促反应动力学：研究各种因素对酶促反应速率的影响，并加以定量的阐述。 影响因素包括：酶浓度、底物浓度、pH、温度、抑制剂、激活剂等。 碱性磷酸酶米氏常数的测定 原理 米氏常数是酶促反应动力学中的一个相当重要的常数，通过实验，可理解并掌握利用实验求出Km的方法。 在酶促反应中，当反应体系的温度、 pH及酶浓度恒定时，底物浓度对反应速率的影响呈矩形双曲线关系。 本实验以碱性磷酸酶（AKP）为材料，用磷酸苯二钠为其底物。 AKP催化磷酸苯二钠水解产生游离酚和磷酸盐。酚在碱性溶液中与4一氨基安替比林作用，经铁氰化钾氧化，可生成红色的醌衍生物。 根据红色的深浅可测出酚的含量，进而算出相应的酶活性 (V)。 再根据Lineweaver—Burk法作图，计算其Km值。 操作 底物浓度对酶促反应速度的影响 1)取试管8支，按下表操作(应特别注意准确吸取底物溶液及酶液)： 加入酶液立即计时，混匀后置37℃水浴准确保温15min。 2)保温结束，各管立即加入碱性溶液1ml以终止反应。 3)各管中分别加入4-氨基安替比林溶液1ml及0.5％铁氰化钾2ml，混匀，放置l0min，以第8管调零点，于510nm波长处比色，测定各管吸光度。 酶促反应速度计算 酶促反应速度以每15分钟所产生酚的微克数(μg ／15min)来表示。 根据酚标准曲线查出各管的酚含量，即各管在不同底物浓度下的反应速度。 本实验不制作酚标准曲线，而以1／[S]对1／A作图，因各管吸光度与其酚含量成正比，故可用吸光度代表酶促反应速度。 注意事项 (1) 该实验的成功与否，在很大程度上取决于各种试剂(特别是底物溶液和酶液)吸液量的准确性。 (2) 加入酶液立即计时，混匀后置37℃水浴准确保温15min。 实验记录 碱性磷酸酶米氏常数的测定 日期、室温 实验报告碱性磷酸酶米氏常数的测定 日期 室温 一、实验目的 二、实验原理 三、数据处理 （一）绘制米氏方程式曲线 （二）绘制双倒数曲线 四、实验结果：AKP的Km= ? mmol/L 五、实验讨论 （一）绘制米氏方程式曲线 AKP米氏方程式曲线图 （二）绘制双倒数曲线 AKP的双倒数曲线图 AKP的竞争性抑制 操作 实验记录 碱性磷酸酶的竞争性抑制剂实验 日期、室温 实验报告碱性磷酸酶的竞争性抑制剂实验日期 室温 一、实验目的 二、实验原理 三、数据处理 绘制双倒数曲线 四、实验结果： 五、实验讨论 （二）绘制双倒数曲线 * * 米氏方程式：反应速率与底物浓度关系的数学方程式。 [S]：底物浓度 V：不同[S]时的反应速率 Vmax：最大反应速率(maximum velocity) Ｋm：米氏常数(Michaelis constant) Ｖ Vmax[S] Km + [S] ＝ ── Vmax V [S] Km Vmax/2 Km值等于酶促反应速率为最大反应速率一半时的底物浓度，单位是mol/L。 酶底物复合物 E + S E + P ES (过渡态) Vmax[S] Km+[S] V = （林－贝氏方程） + 1/V= Km Vmax 1/Vmax 1/[S] 两边同取倒数 双倒数作图法 -1/Km 1/Vmax 1/[S] 1/V A 1 2 3 4 5 6 7 8 0.000 A 1 2 3 4 5 6 7 8 0.000 S mmol/L 2 3 4 5 6 8 16 0 Ｖ Vmax[S] Km + [S] ＝ ── Vmax A [S] Km Vmax/2 1/A 1 2 3 4 5 6 7 8