凝胶层析（五年制）.ppt

凝胶层析（分子筛层析法）分离物质 葡聚糖凝胶柱层析分离物质 凝胶柱层析分离 ▲ 加样与洗脱 ▲ 凝胶的再生 ⑤.收集 用“-”表示无现象，用“+”, “++”, “+++”等表示颜色深浅 【实验目的】 1．熟悉层析技术概念，分类 2．掌握凝胶通透层析基本原理 3．掌握凝胶通透层析法的操作 4．熟悉物质层析柱中洗脱行为与分配系数（Kd）的关系 本试验采用葡聚糖凝胶——Sephadex G 50层析方法，以蓝葡聚糖 2000（分子量2000 kD)、DNFP-甘氨酸（分子量0.5 kD)的混合物通过交联葡聚糖G-50的层析柱，以蒸馏水为洗脱溶剂进行洗脱。 凝胶层析原理： 凝胶层析法是按混合物各组分分子量大小不同随流动相经过层析柱的时间不同而被分离的技术。 凝胶是一类具有三维多孔网状结构的干燥颗粒，当吸收一定量溶液后溶涨成柔软、富有弹性、不带电荷、不与溶质相互作用的惰性物质，凝胶层析以其为固定相。层析时，直径大于凝胶网孔的大分子物质不能进入凝胶内部，只能沿着凝胶颗粒间的间隙随流动相向下移动，所以流程短、流速快，首先流出层析柱；而小分子物质直径小于凝胶网孔能自由出入，洗脱时间长，后流出层析柱，经过一定时间层析，分子大小不同的物质彼此分开，达到分离的目的。 凝胶层析法分离物质 数学模型 Vo Vi Ve Vi—凝胶孔内水（内水） Vo—颗粒间水（外水） Ve—洗脱体积 洗脱总体积Ve = Vi +Vo 在洗脱液的洗脱下，混合物中分子量最大的物质最先出柱，分子量最小的物质最后出柱；介乎中间的物质，则分子量愈大洗出愈快，分子量愈小洗出愈慢。这样，不同的物质就被分离。 混合物中各物质在凝胶柱内层析时的洗脱行为和各自的分配系数Kd有关。 Kd — 分配系数：精确衡量混合物中某一待分离成分在凝胶柱内的洗脱行为，反映物质分子进入凝胶颗粒的程度，是溶质分子大小的一个函数 Ve—洗脱体积：分离物被洗脱时所用的洗脱液体积 Ve = Vo + Kd·Vi 洗脱曲线：以洗脱体积为横坐标，各物质颜色度为纵坐标作图 在洗脱过程中，被洗脱成分的洗脱行为可以有三种可能的情况： (1)Ve=Vo，表示被洗脱的某成分流经层析柱全程所需的洗脱液体积和凝胶颗粒间隙的总体积相等。即该成分的分子全部被排阻在凝胶颗粒的间隙中，而未进入凝胶颗粒内部，因而洗脱速度最快，被最先洗脱出来。即该成分的Kd＝0。 (2)Vi＝Ve-Vo，表示某成分被洗脱出来所需洗脱液的总体积和凝胶颗粒外部孔隙的总体积之差，等于凝胶颗粒内部的总体积。即该成分不被排阻而被滞留，可完全进入凝胶颗粒内部。因而洗脱速度最慢，被最后洗脱出来。即该成分的Kd=l。 (3)Kd值介于0~1之间，在此范围内，物质的洗脱速度随其Kd值的增加而降低，Kd值越大，被排阻的程度越小，即被滞留的程度越大，洗脱速度越慢；反之，Kd值越小，被排阻在外的程度越大，洗脱速度越快。 （1）完全被排阻的极端大分子，Ve =Vo，Kd =0 （2）中等分子，Ve =Vo + Kd·Vi，0Kd 1 （3）完全渗透的小分子，Ve =Vo+Vi， Kd =1 Vea=Vo Vi Veb Vec=Vo+Vi [原理] 本实验将蓝葡聚糖2000(分子量2000KD)和DNFP-甘氨酸 (分子量0.5KD)的混合物通过交联葡聚糖凝胶G-50的层析柱以蒸馏水为洗脱溶剂进行洗脱。 蓝葡聚糖2000分子量最大全部被排阻在凝胶颗粒的间隙中，而未进入凝胶颗粒内部、因而洗脱速度最快，最先流出柱，其Ve＝Vo即Kd＝0。 DNFP-甘氨酸，分子量最小不被排阻而可完全进入凝胶颗粒内部洗脱速度最慢，最后流出柱，其Ve＝Vi+Vo即Kd＝1。 可以直接从蓝、黄两种不同颜色直接观察到两种物质分离的情况，并通过洗脱体积可以计算Vi、Vo和各自的Kd。 ▲ Sephadex G-50的准备 ▲ 装柱（18cm） 操作步骤： 1、层析柱保持垂直。 2、放蒸馏水，排沙芯下空气，关闭出口。 3、加入搅拌均匀的SephadexG-50悬液，调节流速10滴/min，使凝胶均匀沉降，不断补充，直至18cm。 4、上留1-2mm的水，关闭出口。 注意：★ 床面上要保持少许水，防止胶床露出液面。 ★ 胶面不平，用玻棒轻轻搅动，让凝胶自然沉降， 使表面平整。 1、加样：用滴管将约0.5ml样品加入柱床面，打开出口使样 品溶液渗入凝胶。 2、洗脱与收集：加入洗脱液，打开出口，保持流速 15滴/min，收集洗脱液，每管收集1ml （20滴） 。 3、绘制洗脱曲线：以洗脱体积为横坐标，洗脱液