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2015-09-18 发布于重庆
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蛋白质间相互作用研究方法：免疫共沉淀.pdf

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蛋白质间相互作用研究方法：免疫共沉淀

中国试剂网 3.9.128 蛋白质间相互作用研究方法：免疫共沉淀相互作用在生理上的证实和探索  通过免疫共沉淀确定结合蛋白 1．用磷酸盐缓冲液洗30 块10 cm 培养板上的适宜细胞。刮去每块板上的细胞到 1 ml 冰冷的EBC 裂解缓冲液中。 2 ．将每毫升细胞悬液转移到微量离心管中，在微量离心机上 4 ℃以最大速度离心15 min。 3 ．收集上清（约30 ml ）并加入30 μg 的适当抗体，4 ℃摇动免疫沉淀物1 h。 4 ．加入0.9 ml 的蛋白质A-Sepharose 悬液，4 ℃摇动免疫沉淀物30 min 。 5 ．用含900 mmol/L NaCl 的NET 洗蛋白A-Sepharose 混合物，再重复洗5 次。最后，用NET 洗一次。 6 ．吸出混合物的液体部分。加入800 μl 的1×SDS 胶加样缓冲液到球珠中，煮沸4 min 。 7 ．将样品加入到大孔的不连续SDS梯度胶中，在10 mA 的恒定电流下电泳过夜。 8．通过考马斯蓝染色观察蛋白质泳带。 9 ．从胶上切下目标带，将其放到微量离心管中，用1ml 50%乙腈洗两次，每次 3 min 。 10．用胰蛋白酶消化胶中的蛋白质，再将肽电洗脱。 11．通过窄孔高效液相色谱分离肽。将收集的肽在ABI 477A 或494A 机器上进行自动Edman 降解测序。