蛋白质的色谱分离2(英文).pptVIP

●分离 分子量相差较大的蛋白质(至少差20-30kD) ●蛋白质纯化过程中的除盐 常用的凝胶是葡聚糖凝胶G-25 ●蛋白质分子量的测定 ●研究蛋白质二聚体或寡聚体的存在与否 凝胶过滤层析的用途 proteins salts 葡聚糖凝胶G-25 Desalting proteins ? ● 凝胶介质的处理 1份凝胶加十份水 自然溶胀至少24小时 将上清中细小的凝胶碎块弃除 沉淀后再次弃去凝胶碎块 重复数次直到液相澄清为止 为加速溶胀，可将凝胶煮沸一小时，该法同时具有灭菌的作用 凝胶过滤层析的基本操作 对样品的要求 浓缩 体积约为10-20 mg/ml 过滤 0.2 mm孔径滤膜过滤或10, 000 g 离心5 min 上样量 不超过柱床体积的1-5 % 注意: 避免破坏柱体表面,尽量保持表面 均匀平整 上 样 凝胶柱的再生与保存 再生 用3-5个柱床体积缓冲液洗涤柱体 ↓ 用0.2 mol/L NaOH或1 mol/L NaCl洗涤 ↓ 用非离子型去垢剂0.2-1% NP-40去除 吸附过紧的杂质 保存 0.02% NaN3(抑菌剂)保存在20 %乙醇中保存 Hydrophobic Interaction and Reversed Phase Chromatography (色谱法,层析法) Ion Exchange Gel filtration/ Size exclusion Affinity The most important separate step Chromatography (column, liquid) * Basic AA positively charged Ion Exchange chromatography (IEX) Second step sample application Ion Exchange chromatography (IEX) Third step elution Ion Exchange chromatography (IEX) Third step elution Ion Exchange chromatography (IEX) Third step elution Ion Exchange chromatography (IEX) Final step washing Ion Exchange chromatography (IEX) Re- -equilibration Use some very low ionic buffer (usually use Deionized water ) to regenerate the media 选择正确的缓冲液对离子交换层析的分离结果有着 重要的影响。选择缓冲液应依据下述原则： ◆注意选择与交换剂相对应的缓冲液 阳离子交换剂应选用阴离子缓冲液 （柠檬酸盐、磷酸盐） 阴离子交换剂应选用阳离子缓冲液 （Tris、氨基乙醇胺） 在选择缓冲液的pH时应注意阅读离子交换剂的说明书 Ion exchangers/ stationary phase/ media ◆ 起始缓冲液的浓度应尽可能低 可低于10mM甚至更低,这样可以使层析柱上更多地 吸附分离物质 ◆ The pH of the start buffer should be at least 0.5–1 pH unit above the pI of the target substance when using an anion exchanger (Q, DEAE or ANX) or 0.5–1 pH unit below the pI of the target substance when using a ation exchanger(SP or CM). ◆色谱柱一般采用粗短柱（长柱增加了从吸附位置到收 集位置的流程距离，易增加样品扩散，导致峰宽加） ◆离子交换色谱柱的柱床体积应是加入样品体积的2-5倍 ◆要增加离子交换剂