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本科学生综合性实验报告 学号： 094120275 姓 名： 陈 小 华 学院： 生命科学学院 专业、班级：09应用生物教育B班 实验课程名称： 胡萝卜的细胞悬浮培养及体细胞胚诱导 教 师： 杨 世 忠 开 课 学 期： 2011 至 2012 学年 第二 学期 填 报 时 间： 2012 年 6 月 15 日 云南师范大学教务处编印 一．实验设计方案 实验序号 实验二 实验名称 胡萝卜的细胞悬浮培养及体细胞胚诱导 实验时间 2012年5月-6月 实验室 生物院组培实验室 （一）实验目的 1、熟练掌握愈伤组织继代培养的基本操作技术。 2、进一步熟悉、规范无菌操作技术。 3、设计和配制胡萝卜细胞悬浮培养的培养基。 4、掌握胚状体诱导发生的一般技术。 （二）实验原理及实验流程或装置示意图 1、实验原理 (1) 细胞悬浮培养是指将游离的植物细胞按一定的细胞密度，悬浮在液体培养基中进行培养的方法。其主要优点是：能大量提供比较均匀一致的细胞，也就是同步分离的细胞；细胞增殖的速度比愈伤组织快；适宜大规模培养，成为细胞工程中独特的产业。 （2）要进行细胞悬浮培养和体细胞胚的诱导实验就得获得单细胞，单细胞的获得的方法有由完整的植物器官分离由培养组织中分离单细胞广泛用于分离叶肉细胞的方法是先把叶片轻轻研碎，然后再通过过滤和离心把细胞净化。旋转转速过高或冲程过大会造成细胞的破裂。悬浮培养细胞悬浮培养的培养基一般来说也同样适用于由愈伤组织的类似薄壁组织细胞不经有性过程而直接产生类似胚的这一结构，称为胚状体。胚状体方式指由培养细胞诱导分化出具胚芽、胚根、胚轴的胚状结构，进而长成完整植株。胚状体形成在植物有性生殖中，精子和卵结合形成合子，合子进一步发育成胚。但在组织培养条件下胚状体的发育过程是：细胞经脱分化后，发生持续细胞分裂增殖，并依次经过原胚期、球形胚期、心形胚期、鱼雷形胚期和子叶期，进而成为成熟的有机体。细胞计数细胞密实体积(PCV)、细胞鲜重 细胞干重培养细胞活力的测定相差显微术法伊凡蓝染色法 2、实验流程 （三）实验设备及材料 1、主要实验用具和仪器 冰箱、普通天平、分析天平、各种型号的试剂瓶、移液管、量筒、烧杯、容量瓶、搪瓷杯。PH试纸、药勺、称量纸、灭菌锅、摇床、倒置显微镜、过滤筛、培养皿等。 2、药瓶和试剂 硝酸铵、硝酸钾、氯化钙、硫酸镁、磷酸二氢钾、碘化钾、硫酸锰、硫酸锌、钼酸钠、硫酸铜、氯化钴、乙二胺四乙酸二钠、硫酸亚铁、甘氨酸、盐酸硫胺素、盐酸吡哆素、烟酸、肌醇、2、4-D、NAA（a-萘乙酸）、6-BA（6-苄基腺嘌呤）、弄盐酸、氢氧化钠、95%酒精、蒸馏水、水解酪蛋白、氯化汞等。 3、实验材料：健康疏松的胡萝卜愈伤组织。 (四)、实验方法步骤 1、培养基的配制（具体步骤不再赘述） （1）、继代培养基配方如下： MS基本培养基＋0.1mg/L 6-BA＋2mg/L NAA + 200mg/L水解酪蛋白+ 3％蔗糖 （2）、诱导培养基配方如下： MS基本培养基＋200mg/L水解酪蛋白＋3％蔗糖 2、细胞悬浮培养 （1）相关工具的消毒灭菌。 （2）在无菌条件下，用镊子夹取胡萝卜根的愈伤组织，置于盛有虑纸的无菌培养皿当中，将愈伤组织切成适当大小，同样也可以将愈伤组织捏碎，用解剖刀挑取愈伤组织接种于细胞悬浮培养基中。接种的愈伤组织量可略多一点。 （3）接种后将三角瓶置于摇床上，转速一定，在25-27摄氏度下培养。 3、继代培养。（由于时间关系以及条件有限，本次实验只进行了一次悬浮培养） 在接种两个星期之后继代。继代方法是：先用孔径为100um的无菌尼龙滤筛将培养物滤去。除去滤筛上的愈伤组织碎块和大的细胞团。 4、通过镜检查看实验结果。 用一定规格的无菌尼龙滤筛将培养物过滤，滤出含单细胞的液体盛于一洁净的培养皿内。在倒置显微镜下观察单细胞。 （理论上还应对培养物中进行单细胞计数以及活力测定，但因条件有限，未能完成。这是本次实验的一大遗憾。） 5、体细胞胚的诱导。（由于时间关系，该步未来得及完成。） 将镜检合格的细胞过滤培养液转移到胚状体诱导培养基当中，培养瓶封口后置于黑暗条件下培养。一段时间后，在倒置显微镜下进行镜检，观看愈伤组织的诱导情况。 （五）、注意事项 1、培养所有的培养基应尽可能新鲜，以免造成污染。 2、本实验依然需要注意无菌操作技术。关于这一点由于前面已经讲的太多，这里就不再重述。 3、震荡可以防治细胞缺氧死亡，防治大的细胞团的形