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Gab2对胶质瘤侵袭的影响与机制研究 博士研究生：史立宏 指导教师：罗荣城 摘 要 胶质瘤是中枢神经系统最常见的恶性肿瘤，发病在所有颅内肿瘤约占40％， 侵袭性高和预后差是胶质瘤的典型特征。高侵袭性会导致高复发率和高死亡率， 因此迫切需要深入理解胶质瘤侵袭的分子机制，从而针对性地研究防治胶质瘤 侵袭的药物和方法，改善患者的预后。 Gab2是支架蛋白DOS／Gab家族的一个成员，这个家族还包含哺乳动物的 及含多个磷酸化酪氨酸残基的C端。Gab蛋白绝大多数是间接通过Grb2介导聚 集于活化的受体。在各种刺激下，Gab2发生酪氨酸磷酸化产生数个锚定位点来 亚基的结合在P13K．Akt．mTOR信号通路中起重要作用。 近来，一系列的研究显示Gab2与肿瘤细胞的迁移和侵袭有关。首先，Gab2 被检测到在乳腺癌细胞系与原发肿瘤中高表达。在Her2／Neu介导的沉默Gab2 的小鼠模型中Gab2缺乏的细胞迁移能力降低，小鼠乳腺癌发生的肺转移也减少， 提示Gab2能促进乳腺癌的转移。其次，有研究发现卵巢癌组织中Gab2高表达， 而且Gab2通过活化P13K通路促进卵巢癌细胞的转移。另外Gab2也高表达于恶 性黑色素瘤、胃癌、肺癌及急性髓性白血病。然而，到目前为止，Gab2蛋白在 胶质瘤中的表达及Gab2是否影响胶质瘤细胞的迁移和侵袭尚不明确。 本研究首次检测了Gab2在胶质瘤中的表达，探讨了Gab2在胶质瘤侵袭中 的作用，结果提示Gab2在胶质瘤侵袭中有重要作用，可以作为判断胶质瘤预后 的有效分子指标。 摘要 方法 1．组织标本 163例福尔马林固定石蜡包埋的胶质瘤组织来源于1997年1月到2007年 12月之间在潍坊医学院附属医院与潍坊市人民医院接受脑胶质瘤手术切除的患 者，其中胶质瘤I级(pilocytic 脱水包埋，5um连续石蜡切片及HE染色，每例病理切片均经两位病理医师确诊。 按国际抗癌联盟(uIcc)帝U定的胶质瘤分期标准对患者的详细临床资料进行分 析。 2．免疫组织化学 按照SantaCruz公司所提供的操作步骤进行。切取5um厚的组织切片，二 甲苯脱蜡，梯度酒精脱水，柠檬酸缓冲液和微波加热进行抗原修复，过氧化氢 孵育中和组织中的过氧化氢酶，滴加羊血清封闭，加一抗37℃孵育30min后置 于40C冰箱过夜。第二天加亲合素结合的二抗，ABC溶液孵育，DAB染色，苏 木精复染细胞核，脱水、透明、干燥后封闭液封片，光学显微镜下观察。 3．IHS评分法评分 结果判断由两名经验丰富的病理学教授，对免疫组化切片结果判断评估。 细胞质或者核内见淡黄色细颗粒显著高于背景颜色为阳性细胞。每张切片选取5 个高倍视野观察结果。采用IHS评分法，分数可能范围O～12。IHS分值9～12为 —j一—．-、● 局表达。 4．免疫印迹实验 组织／细胞蛋白提取：剪取适量组织并尽量剪碎，加入ⅪPA裂解液(含ImM DTT和蛋白酶抑制剂)，4C搅动裂解20min。细胞蛋白的提取则向生长铺满瓶底 的培养瓶中加入lmL预冷的RIPA裂解液，冰上晃动20min。取得的蛋白裂解液 13000 RPM离一L,10min，测定上清蛋白浓度。加适量体积的上样缓冲液，煮沸变 博士学位论文 性。免疫印迹检测：蛋白溶液经SDS电泳、转膜，用含5％脱脂奶粉的TBST封闭 抗并置于水平摇床摇动2h。按上述方法洗膜后力HECL并曝光。以目的蛋白条带的 灰度值与内参照蛋白条带的灰度值的比值表示蛋白的相对表达量。实验重复3 次。 5．细胞培养与转染 1640培养 粒与 Gab2 RNA 特异性小 干扰质粒(干扰序列撑l： ≠}2： 5’一GTGAGAACGATGAGAAATA一3’； G418(新霉素)的培养基进行筛选。选择干扰效率 使用含有终浓度为0．7ug／mL 高的稳定转染的单克隆细胞用于后续试验。