夜蛾科昆虫胚胎超低温保存和研究.pdf

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夜蛾科昆虫胚胎的超低温保存研究 专业:动物学 博士生:罗丽 指导老师:庞义教授 摘 要 本文选取鳞翅目夜蛾科昆虫一甜菜夜蛾作主要对象,系统研究了甜菜夜蛾 胚胎的超低温保存技术及处理程序对胚胎发育,孵化幼虫的影响。此外,对斜 纹夜蛾胚胎的超低温冷冻保存也作了初步研究。 作者研究了5种传统保护剂(二甲基亚砜,甘油,甲醇,l,3一丙二醇,乙二 醇)和3种新型保护剂(2-氨基.1一乙二醇,3一氨基一1一丙醇及3.甲氧基.1,2.丙 二醇)对甜菜夜蛾胚胎的毒性及其玻璃化能力,从中筛选出乙二醇作为保存甜 菜夜蛾胚胎的低温保护剂。 发育50h的甜菜夜蛾卵,经14%次氯酸钠及正已烷去除外卵壳和蜡质层后, 获得了99.8%的渗透率,70%左右的孵化率。利用乙二醇对去卵壳后的甜菜夜 mol/L mol/L moI/L 蛾胚胎进行三步法渗透(2 EG EG,5min}8 5min一4 稀释3rain,覆盖石蜡油保湿孵化,可获得8.8%的孵化率。把三步渗透法第三 步的乙二醇浓度提高到8.6M一9M,并延长渗透时间,不覆盖石蜡油进行保湿孵 化,可以获得1.55—4.12%的孵化率。由以上程序冻存的胍胎所孵化幼虫,其外 部形态及行为表现异常,即体色透明,行动缓慢,黑色素减少,不主动取食, 48h内死亡。 深入研究表明,去卵壳处理过程不影响胚胎发育及孵化幼虫的生长发育, 保护剂的渗透及在胚胎中的残余,诱导胚胎期酚氧化酶和初孵幼虫海藻糖酶活 性的升高,基因组DNA去甲基化,初孵幼虫表皮的鞣化和硬化过程受阻,形 成肿胀型幼虫,但是这些影响都可以修复,对孵化幼虫不造成致命性损伤。冻 存及复温过程对胚胎发育的影响最大,基因组DNA去甲基化,‘C孔消失,表 皮肿胀,中肠受损,其中复温过程中保护剂的反玻璃化及大冰晶的形成是造成 孵化幼虫最终死亡的直接原因。 其它发育期的甜菜夜蛾卵对去卵壳及保护剂处理都极其敏感,液氮冻存后 均无法孵化。改用天然饲料喂养甜菜夜蛾,虽然可以提高虫卵对保存程序的抗 性,但冻存后也不能成功孵化。和甜菜夜蛾相比,发育至35h和50h的斜纹夜 蛾胚胎对化学物质的处理更为敏感,胚体极易变形破裂,难以实现超低温种质 保存。 实现一个物种的超低温保存是一项非常耗时的研究,本研究为以后研究奠 定了基础,探明了昆虫胚胎超低温冻存程序的改良方向。 关键词:冷冻保存,玻璃化,胚胎,保护剂,甜菜夜蛾,斜纹夜蛾 onthe ofNoctuidaeinsect Studies cryopreservation embryos Speciality:Zoology Name:LnoLi Yi Supervisor:ProfessorPang ABSTRACT Thevitrification andtheeffectsfrom ofSpodopteraexiguaembryos procedures werestudied.Thevitrification litura hadalsobeentried. ofSpodopteraembryos selectedfrom8kindsof Ethyleneglycol(EG)was tested,includingmethanol,ethylene

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