ACC氧化酶基因反义表达载体构建与对白姜花愈伤组织转化.pdf

ACC氧化酶基因反义表达载体的构建 及其对白姜花愈伤组织的转化 专业：植物学 申请人：李晓娇 导师：黄学林教授 摘要 花卉产业已成为世界上最具活力的产业之一。人们通过常规杂交育种、辐射 育种、组织培养育种、多倍体育种、航天育种等手段培育了大量的花卉新品种。 尤其是二十世纪九十年代以来，随着分子生物学和基因工程技术的发展，利用转 基因技术培育新品种成为育种工作者研究的热点。将目的基因定向导入植物细胞 或组织中，培育成植株，则可获得人们预期的新品种，从而为花卉的定向育种提 供了一条更有效的新途径。 白姜花(Hedl，，chiumcoronarium)为姜科姜花属一种多年生草本植物。其花 色洁白、花型美丽、花香宜人，极具观赏价值，深受消费者青睐，在我国南方广 泛栽培并主要用作香型切花、庭院绿化和园林景观植物。然而，白姜花切花的瓶 插寿命较之其他切花短，一般只有2．3天。研究已表明，乙烯在自姜花衰老过程 中可能起着重要作用。因此控制切花开放过程中乙烯的产量是延迟衰老的有效途 径之一。通过农杆菌介导的遗传转化方法导入乙烯合成相关反义基因或利用 RNAi技术，抑制白姜花切花的乙烯合成，将是获得花期延长的白姜花新品种的 非常值得探索的育种途径。 本论文旨在已建立白姜花再生体系的基础上，利用苜蓿ACC氧化酶基因片 段，构建ACC氧化酶基因反义表达载体，优化影响该基因农杆菌介导的遗传转 化体系的主要因素，以期将反义ACO基因导入到白姜花中，获得花期延长的白 111 姜花花新材料。主要研究结果如下： 1．优化了白姜花花丝愈伤组织继代培养基，研究了2，4．D对白姜花花丝愈伤组 织生长的影响。结果发现，2，4-D浓度为2．0mg／L的花丝继代培养基中，愈伤组 织增殖速度最快，同时，在一定程度上也减少了愈伤组织的褐变，利于继代培养。 合适的白姜花花丝愈伤组织继代培养基成分为：MS+6-BA(1．0 rag／L)+2,4-D (2．0 mg／L)+NAA(4．0mg／L)。 2．从实验室保存得苜蓿叶片ACC氧化酶基因片段中亚克隆了814bp的片段，构 建了ACC氧化酶基因片段反义表达载体：将苜蓿ACC氧化酶基因该片段反向插 入带有XbaI和BamHI两个酶切位点的pMD20．T I／BamH 质粒；用Xba 小片段和14kb大片段，二者连接克隆到15．coliDH5a中扩繁；提取质粒对表达载 体进行酶切验证并测序，证实反义ACO基因已插入pBll21多克隆位点。将此质 基因和nptll基因。然后通过冻融法将其转入农杆菌EHAl05。 3．建立了白姜花花丝愈伤组织为受体的转化体系：首先研究了花丝愈伤组织的 Cef脱农杆菌的浓度、卡那霉素(KMl筛选浓度以及影响转化频率的因素。确定白 姜花愈伤组织的根癌农杆菌介导的转化体系：愈伤组织继代培养基为MS+6-BA (1．0mg／L)+2,4一D(2．0mg／L)+NAA(4．0mg／L)。根癌农杆菌离心后悬浮于愈伤组 织继代液体培养基中作为农杆菌工程菌液。花丝愈伤组织在OD600=0．2的根癌农 杆菌菌液中浸染30rain后，在花丝愈伤组织分化培养基(DM-F：’MS+0．1r11l扎 KlVl TDZ+0．2 Cef为脱菌浓度，含75ml／L mg／LNAA)上共培养3．4d；以500mg／L 的DM．F培养基上进行愈伤组织抗性筛选。 4． GUS基因表达的组织化学染色表明，拟转化愈伤组织出现蓝色反应，说明 义基因和GUS基因是顺序串联排列，因此初步判定ACC氧化酶反义基因已经转 IV 入白姜花花丝愈伤组织中。 关键词：白姜花、ACC氧化酶基因、反义表达载体、转化、GUS基因 V