“毒损脑络”病机假说的细胞生物学基础的研究.pdf

中文摘要 中文摘要 缺血性脑血管疾病是一个重要致死及致残疾病，具有发病率、致残率、复发率高的 特点。目前尚无一疗效突破性药物，尤其是仍未使脑损害的致残得以根本解决。缺血性 中风属中医“络病”范畴，“毒损脑络”是其的病机关键，临床上从络脉的功能特点入手 进行论治取得了显著的疗效。虽然络脉不等同于现代医学的微循环，络脉在很大程度上， 其结构定位与西医学的微循环甚相似。从目前络病生物学基础的研究来看，血管内皮细 胞损伤在络病的多个病理环节中发挥着重要作用。现代医学研究也日益认识到血管内皮 细胞对微环境的多种影响，除影响血管张力外，还调节血管细胞生长、迁移、基质降解、 血栓形成和白细胞粘附等，并可活化多种细胞受体和信号传递途径。内皮细胞产生的细 胞因子通过旁分泌或自分泌的形式在其生成的微环境直接发挥作用，对维持内环境的平 衡稳定具有重要的调节和控制能力。因此，我们在中医络脉理论的指导下，以脑微血管 MicrovascularEndothelial 内皮细胞(Brain Cells，MVEC)为切入点，研究了体外培养的 脑微血管内皮细胞分泌功能对神经元的影响，并应用蛋白组学技术对不同内皮细胞条件 培养液的差异蛋白进行分析，来探讨微血管内皮细胞对神经元实现调控作用的特征及其 物质基础 目的： 研究在生理、拟缺血损伤以及药物作用下体外培养的脑微血管内皮细胞条件培养液 对神经元活胜、游离钙离子浓度、NMDA受体以及线粒体功能的影响，并应用蛋白组学 技术对不同内皮细胞条件培养液的差异蛋白进行分析，来探讨微血管内皮细胞对神经元 实现调控作用的物质基础，以期为“毒损脑络”病机理论提供现代生物学依据，为中药 治疗中枢神经系统疾病的作用途径与靶点提供有意义的思路。 方法： 1．进行大鼠脑微血管内皮细胞的元代培养与鉴定：采用组织匀浆、两次过滤以及胶原酶 消化等方法获得脑微血管内皮细胞，进行培养、纯化和传代。并用Ⅷ相关抗原免疫荧光 标记进行鉴定。 2．建立脑微血管内皮细胞拟缺血损伤模型：采用细胞缺氧合并培养液缺糖方法，观察 MVEC在不同的损伤时间点活性的变化，从而建立可靠的MVEC体外拟缺血实验模型。 3．筛选通络救脑注射液用药浓度：观察各浓度梯度的通络救脑注射液对正常、拟缺血损 伤MVEC活性的影响，确定通络救脑注射液发挥药效的最佳浓度。 4．确立脑微血管内皮细胞条件培养液收集时间：观察正常、正常用药、拟缺血损伤、拟 缺血损伤用药四种MVEC在相应的处理完毕后，继续在无血清培养的条件下活性的变化 规律，以及不同时间点收集的四种条件培养液对大鼠皮层神经元活性的影响，从而确立 条件培养液的最佳收集时间。 5．观察不同脑微血管内皮细胞条件培养液对正常和受损神经元的影响：制备正常、正常 用药、拟缺血损伤、拟缺血损伤用药四种脑微血管内皮细胞条件培养液(N．CM、NT-CM、 元活性变化；②荧光探针Fluo一3／AM标记，观察神经元Ca2+浓度的变化；③免疫荧光标记 大鼠脑微血管内皮细胞对神经元活性的影响及其相关机制探讨 体膜电位的变化；⑤免疫荧光标记法检测神经元细胞色素C(Cyt—c)的释放水平。 6．大鼠脑微血管内皮细胞条件培养液的差异蛋白质组学分析：采用～维SDS．PAGE与 异蛋白进行鉴定，利用sⅥSs．PROT数据库检索，搜寻每个蛋白质的相关信息并整理分 析。 结果： 1．形成了完善的大鼠脑微血管内皮细胞培养体系，培养的脑微血管内皮细胞纯度达95％ 以上；成功建立了体外拟缺血损伤的模型：并确定通络救脑注射液发挥药效的最佳浓度 为1Ij_l／rnl，条件培养液的最佳收集时间为6小时。 2．四种MVEC条件培养液对正常、损伤神经元活性的影响 N—CM对正常神经元活性无明显影响，但对损伤的神经元表现出一定的保护作用： NT-CM对受损的神经元有明显的保护作用；I-CM可引起正常神经元损伤，对已受损的 神经元则可进一步加重损伤：IT-CM的损伤作用明显减轻，甚至消失。 3．四种MVEC条件培养液对正常、损伤神经元ca2+、NMDARl表达的影响 cd+浓度较I．CM组下降。 用更为明显；I-CM则迸一步加重损伤神经元的钙超载，而对增强损伤神经元的NMDARl 表达作用不明显；与I-CM处理组相比，IT-CM处理组神经元钙离子浓度明显下降， NMDARl的表达也有减少趋势。 4．四种MVEc条件培养液对正常、损伤神经元A