DNA芯片原位合成与检测新技术的分析.pdf

摘 要 DNA芯片技术作为一种高通量DNA分析检测方法，近年来备受关注。DNA芯片把大量已 知序列探针集成在基片上，通过与标记的若干靶核酸序列杂交，可以对生物细胞或组织中大 量的基因信息进行检测和分析。随着人类基因组计划的完成以及功能基因组研究的深入，要 求对火量的基因信息进行高灵敏度、高特异性、定量化的检测。这对DNA芯片技术提出了挑 战，同时也为DNA芯片技术的发展提供了机遇。寡核苷酸芯片的原位合成是制各高密度和高 特异性DNA芯片的重要途径，是DNA芯片技术的重要发展方向。由丁DNA芯片的原位合成 条件苛刻、技术复杂、试剂成本高，国际上开展DNA芯片原位合成研究的单t|7=很少。目前仅 有美国Affymetrix公司生产高密度基因芯片，该公司应用的光脱保护DNA芯片原位合成技术 仍存在制各成本高、单步合成产率较低等问题，尚有待于完善。另一方面，发展高敏度的标 记技术也还是DNA芯片技术的一个重要方向。但目前的研究主要集中在提高标记的效率和提 高检测的灵敏度方面，而在降低芯片基底背景信号方面的考虑似乎不多。 为此，本文提出，{：实现了软光刻技术制备DN脐片的新方法。软光刻技术制备DNA芯片的 原位合成方法通过一套高精度定位压印系统，以聚二甲基硅氧烷(PDMS)印章为图案转移模 板将DNA合成试剂多次压印定点分配在基片上，从而实现多层组合原位台成寡核苷酸探针序 列一目ODNA芯片的制各。该方法具有操作简单、成本低、单步合成产率高等特点。同时，本文 提出并发展了～种时间分辨荧光标记的新型DNA芯片检测技术。时间分辨荧光标记的稀七探 针较之传统荧光探针，具有荧光寿命长，斯托克位移大，不受背景干扰的优点。通过时间分辨 检测技术，可以把被标记的荧光信号从基底的荧光背景中分离出来，实现在各种基底(如玻 璃、硅胶、聚合膜材料等)上的DNA芯片均相或非均相时间分辨荧光检测与分析。本文的工 作主要集中丁‘研究采用软光刻技术制备DNA芯片的方法和工艺，以及发展一种时间分辨荧光 标记的新型DNA芯片检测技术两个方面。 本文对软光刻技术制祭DNA芯片中的若干问题进行了深入的研究，特别是在软光刻技 术的关键工艺——高质量大面积分子印章的制各方面进行了大量的创新研究。主要研究结果 包括如下几个方面： l PDMs印章是软光刻技术幽案转移的关键，其变形与扭曲将直接影响多层定位与寡核苷 酸序列组台合成。本文提出了一种对分子印章的角度扭曲进行定量评价的新方法，对平 面PDMS印章阵点变形手f{曲进行了定窟分析。这种方法适用于评价各种相同或互补图案 之问的乎面变形扭曲：绝对角度丰抖曲(81)与相对角度扭曲(02)。提出了改善了PDMS 叩章与坡璃基底的科，和性能的分J二印章制备新J一艺，即对分子印章的玻璃板基板上进行 砖烷修饰。蚰f究发现：采_L}』硅烷修饰的玻璃扳墓扳制各的PDMS分子印章不仅馥善了 PDMS印章的粘年¨性能，而且可以有效控制人面积PDMS印章的收缩与扭曲变形。当 10m，其膜厚为1．0X10。3Ill时．硅烷化修饰基板的印章绝 PDMS印章阵点高度为5．0X 10，完全能够满足软光刻 10，相对角度扭曲02小丁1．22x 对角度扭曲0I小于3．98X 技术制备DNA芯片时微米级多层次准确定位的要求。 2． 提出并实现了将所有多层PDMS印章集成在同一固相平面的大面积PDMS印章的思路．解 决了不同印章与合成基片之间压印合成反应的准确定位问题；提出了用表面镀铝(银) 玻璃板作印章母板的方法，解决了大面积PDMS印章和其母板之间的脱模问题，确保了 PDMS印章高保真地复制出模板的图案，此时印章线收缩小于0．043％，阵点面收缩小于 0．3％；据此制备出高质量、高分辨、集成化的PDMS大面积弹性体PDMS印章，利用上述 m×0．26 方法在一块0．18 m玻璃板上制备出168个PDMS印章，为分子印章法用于高 密度DNA芯片技术的实用化奠定了重要的基础。 3． 亲水性PDMS印章的制备是软光刻技术制各DNA芯片的关键。文献上报道的采用氧等 离子的PDMS表面处理会破坏印章上的微结构与形貌，从而