肝细胞胆小管侧膜转运蛋白表达改变与胆色素结石形成的相关性实验研究.pdf

·中文论著摘要· 肝细胞,EJB,J,管侧膜转运蛋白表达改变与胆色素结石形 成的相关性实验研究 目 的 胆色素结石形成机制一直是国内外胆道疾病领域的研究热点，有研究表明胆 汁成分的改变和胆道感染在胆色素结石形成中发挥了核心作用。以往的研究多是 以感染胆汁为中心，通过检测胆汁、胆石成分，围绕Maki学说进行讨论，忽略 了感染状态下可能导致肝细胞原发性分泌及原胆汁成分的改变。国内学者近些年 来对胆色素结石的发病机理展开了广泛的研究，内容涉及免疫、微量元素、氧自 由基、氨基酸含量、游离脂肪酸含量、金属元素在内的多方面研究，但尚无突破 性进展。近半个世纪的研究证明，胆色素结石形成必须有三个必要条件和一个中 心环节。必要条件是胆汁中游离胆色素增多、胆汁中钙离子增加及助溶因素减弱。 中心环节是胆色素钙的沉淀与溶解平衡失调。胆汁的主要成分是胆固醇、胆汁酸 和磷脂，它们都是经肝细胞胆小管侧膜分泌入胆汁。作为胆色素结石的关键成分 胆色素也是通过肝细胞胆小管侧膜转运蛋白分泌入胆汁。目前关于肝细胞的原发 性分泌状态改变导致胆汁成分改变在胆色素结石形成过程中作用的研究甚少。我 们通过建立豚鼠胆色素结石模型，观察胆色素结石形成过程中肝细胞胆小管侧膜 转运蛋白的表达改变，同时观察胆色素结石形成过程中胆汁主要成分的变化情况， 进一步从肝脏原发性分泌状态探索胆色素结石形成的机制。另外采用液相色谱．质 谱联用技术做胆汁代谢组学检测，将成石豚鼠胆汁与未成石豚鼠胆汁的代谢图谱 进行对比研究分析，成石胆汁与未成石胆汁内代谢物得到分离，并将对二组分离 做出贡献的代谢物进一步分析，初步鉴定在胆色素结石豚鼠胆汁中产生了较大差 异的代谢物，推测其可能的分子式及结构，并探讨它们在胆色素结石形成过程中 的作用。 实验方法 一、实验对象 健康豚鼠45只，雌性23只，雄性22只，体质量210～2509，随机分为2组： (对照组／CON组15只，致石组／PS组30只)，适应性饲养一周后，分别给予普 通饲料及致石饲料。致石周期为8周，饲养期结束后观察各指标。 二、标本采集 10％水合氯醛腹腔注射麻醉后采集豚鼠肝脏标本、胆囊胆汁标本、胆石标本， 一80℃保存，另取部分肝脏标本保存在甲醛溶液中。 三、检测指标 1．致石率评定及红外光谱结石定性：解剖显露豚鼠胆囊，肉眼即可清晰辨别 胆囊结石形成情况，采用红外光谱溴化钾压片法，对结石成分进行定性，统计结 石形成率。 2．免疫组化方法研究肝细胞胆小管侧膜胆汁酸转运蛋白(Abcbl1)：肝脏组 织制作石蜡切片，免疫组化方法观察肝细胞胆小管侧膜Abcbll分布情况。 3．免疫组化方法研究肝细胞胆小管侧膜二价胆盐及结合胆色素转运蛋白 (Abcc2)：方法同上。 4．免疫组化方法研究肝细胞胆小管侧膜磷脂转运蛋白(Abcb4)：方法同上。 5．Western Blot法研究肝细胞胆小管侧膜胆汁酸转运蛋白Abcbll转录后的 改变：取肝脏组织标本，提取膜蛋白，SDS凝胶电泳，ECL化学发光法检测肝细 胞胆小管侧膜胆汁酸转运蛋白在转录后水平的变化情况。 6．Western Blot法研究肝细胞胆小管侧膜二价胆盐及结合胆色素转运蛋白 Abcc2转录后的改变：方法同上。 7．Western Blot法研究肝细胞胆小管侧膜磷脂转运蛋白Abcb4转录后的改变： 方法同上。 8．RT．PCR法研究肝细胞胆小管侧膜胆汁酸转运蛋白Abcbl1在mRNA水平 上的改变：取肝组织标本，提取肝脏组织总RNA，扩增目的基因，观察肝细胞胆 小管侧膜胆汁酸转运蛋白在mRNA水平的变化情况。 2 9．RT．PCR法研究肝细胞Nd,管侧膜二价胆盐及结合胆色素转运蛋白Abcc2 在mRNA水平上的改变：方法同上。 水平上的改变：方法同上。 11．胆汁生化学检测。 12．液质联用胆汁代谢组学研究：胆汁应用高效液相色谱分离后，行质谱分 析。 实验结果 一、豚鼠胆囊胆色素结石模型构建情况 对照组豚鼠成石率为14．29％，致石组豚鼠成石率为68．24％，明显高于对照 组。结石含有胆色素和胆固醇