猪α干扰素和白细胞介素-2在真核细胞中表达表达产物活性的分析.pdf

摘 要 目的：α 干扰素（interferon-α）是一种具有广谱抗病毒、抗肿瘤及免疫激活功能的细胞 因子，白细胞介素2 在抗肿瘤、免疫调节及感染性疾病的治疗中也具有重要作用，同时 它还能激活 B 淋巴细胞，参与机体的体液免疫应答，促进抗体分泌，增强体液免疫应答。 Mx 蛋白是Ⅰ型和Ⅲ型干扰素(IFN)诱导细胞后产生的天然抗病毒蛋白，有很好抗病毒活 性，且副作用小。本实验将猪 α干扰素基因和白细胞介素 2 基因分别转染真核细胞，检 测这两个基因的表达，及表达产物的抗病毒活性。为将这两个基因用于疫苗佐剂及转基 因抗病育种动物奠定了基础。同时也克隆了猪Mx1 基因启动子及 Mx1 基因，并构建了 真核表达载体，为进一步研究猪 Mx1 基因奠定了基础。 方法：⑴根据已发表的猪 IFN-α和猪 IL-2 基因的核酸序列设计引物，克隆出这两个基因， 鉴定正确后将两个基因分别连到 pcDNA3.1 载体上构建真核表达载体，分别命名为 pcDNA3.1-IFN 、pcDNA3.1-IL ；⑵用构建好的真核表达载体分别转染真核细胞通过 G418 筛选出转染外源基因的细胞，并用 RT-PCR 进一步检测是否整合外源基因；⑶采用实时 定量 PCR 检测猪 IFN-α和 IL-2 基因在真核细胞内 mRNA 表达水平、采用 ELISA 方法 检测猪 IFN-α 和 IL-2 基因在真核细胞内蛋白表达水平、采用淋巴细胞增殖实验测猪 IFN-α和 IL-2 基因在真核细胞内表达蛋白的生物学活性。(4)根据 Genbank 已公布的猪 Mx1 基因启动子、Mx1 基因的核苷酸序列，设计合成两对特异引物分别扩增了猪 Mx1 基因启动子和 Mx1 基因，并将这两个基因亚克隆到含有 G418 筛选标记的 PGKneotpALox2 真核表达载体上。 结果：⑴成功克隆了猪IFN-α和猪IL-2 基因，经测序鉴定正确，并将其分别连到pcDNA3.1 真核表达载体上，构建成功 pcDNA3.1-IFN 、pcDNA3.1-IL 转染质粒。⑵通过 G418 筛选 出稳定表达猪 IFN-α 和猪 IL-2 基因的真核细胞，经 RT-PCR 鉴定为阳性。⑶实时定量 PCR 表明转入猪 IFN-α基因的真核细胞其 IFN-α mRNA 表达量高于阴性未转染组 1.52 倍，转入猪 IL-2 基因的真核细胞其 IL-2 mRNA 表达量高于阴性未转染组 1.43 倍；对整 合外源基因真核细胞上清液 ELISA 检测结果显示，猪 IFN-α的含量为 121.45pg/mL，而 未转染该基因的对照组含量为 89.36 pg/mL 转染组高于对照组 1.35 倍。猪 IL-2 的含量 为 97.45pg/mL ，而未转染对照组含量为 75.36 pg/mL 转染组高于对照组 1.29 倍；经 SPSS I 统计软件分析表明整合外源基因的真核细胞上清液淋巴细胞增殖作用与阴性对照组相 比均差异显著，表明这两个基因的表达产物有很好的活性，可以用来抗病毒。(4) 成功 克隆了猪 Mx1 基因启动子和 Mx1 基因并将这两个基因亚克隆到 PGKneotpALox2 真核 表达载体上。 结论： 猪 IFN-α和猪 IL-2 基因可以在真核细胞中很好表达，且表达产物具有很好的活 性，为开发新型基因工程疫苗佐剂和转基因抗病动物奠定了基础。同时本实验也构建 了猪Mx1 真核表达载体，为进一步研究 Mx1 基因提供了实验基础。 关键词：猪干扰素 α；猪白细胞介素2 ；真核表达；时实定量PCR ；猪Mx1 II Abstract Objective: Interferon-α is a broad-spectrum anti-viral and anti-tumor cytokines and also activate the immune system. Interleukin-2 plays an important role in anti-tumor, immunomodulat