切应力对种植于聚氨酯小径人工血管表面内皮祖细胞结构与功能影响的实验研究.pdfVIP

中山大学硕士学位 切麻力对种植于聚氨酯小径人工血管表面内皮租细胞结构和功能影响的实验研究 述作用主要通过eNOS的合成增加而致一氧化氮(NO)生成增加，同时切应力作用 下内皮生成超氧化物歧化酶(SOD)增加，导致超氧阴离子(02。)清除增加，从 而使内皮具有抗氧化能力并增加内皮细胞的抗动脉粥样硬化功能及抗炎特性，而 SOD的产生增加也可以使N0清除减少，延长了内皮N0的作用时间，通过测定内 皮祖细胞在切应力作用下分泌NO及SOD含量的改变可以反映内皮祖细胞的生理 功能。 目前有关切应力对内皮祖细胞种植小径人工血管形态和功能的影响国内外 尚未见报道。本研究将内皮祖细胞种植于聚氨酯小径人工血管表面，切应力预处 理聚氨酯小径人工血管表面的内皮祖细胞，观察切应力作用后，内皮祖细胞分泌 NO及SOD的含量，并测定切应力作用前后内皮祖细胞在聚氨酯小径人工血管表 面的贴壁情况，扫描电镜观察切应力作用前后内皮祖细胞的形态的改变，探讨切 应力预处理对内皮祖细胞小径人工血管种植后形念和功能的影响。 实验材料及方法 1． 体外诱导外周血单个核细胞分化成为内皮祖细胞的分离、培养及鉴定 1．1外周血单个核细胞分离 取健康成人外周血约50ml置于肝素管中，并以DMEM洗液稀释。加入 表皮细胞生长因子(EGF)2ng／m1]，将单个核细胞接种在包被有纤维连接蛋白 (fibronectin．FN)的培养板。 1．2细胞培养与鉴定 将上述含有外周血单个核细胞的培养基置于含有5％C0：、37℃孵箱中，每隔 4天换液一次，每次换液量约为2／3左右。同时在倒置相差显微镜下动态观察细 lag／m1)加于上述标本于37。C孵育1h。倒置荧 用PBS浸洗，将FITC--UEAI(10 II 中山大学硕仁学位 切府山对种植于聚氯酯小径人-I=血管表面内皮祖细胞结构和功能影响的实验研究 光显微镜鉴定uEA—I和DiI—acLDL双染色阳性细胞为正在分化的EPC。 2． 内皮祖细胞的种植和切应力处理：将培养两周的细胞用胰酶消化，离心 后制成内皮祖细胞悬浮液，计数细胞，然后将悬液灌入预衬有FN的聚氨酯小径 人工血管，将人工血管两端封闭，置入无菌离心管，在37。C细胞培养箱中以 6rph旋转2小时以使内皮祖细胞均匀的辅垫于人工血管表面。将种植有内皮祖 细胞的人工血管置于切应力处理装置(图1)，切应力装置采用灌流液为DMEM全 液培养基，并且在培养基中含4％的葡聚糖以增加循环中所需要的粘滞度，共50ml 维持循环。然后分四组，一组为静态组，另外三组调节蠕动泵流量分别以切应力 5 大小为5dyn／crn2、1dyn／cm2、25dyn／cm2对人工血管处理24小时，切应力处 理完毕后，部分人工血管用胰酶将内皮祖细胞消化下来，计数切应力处理后贴壁 于人工血管的内皮祖细胞，另外一部分人工血管用戊二醛固定待做扫描电镜。 3． min、180 min及240 注液测定超氧化物歧酶含量。以血清N037N02旅度之和作为NO生成的指标， 采用硝酸还原酶法，利用硝酸还原酶特异性将N03{丕原为N02_’N02与显色 剂作用生成有色物质，检测N0吸光度，按公式[No(umol／L)=(A测定／A标准) ×120]计算N0的浓度。黄嘌呤氧化酶法测定SOD活力，通过黄嘌呤及黄嘌呤氧 化酶反应系统产生超氧阴离子基(02．一)，后者氧化羟胺形成亚硝酸盐，在显色剂 的作用下呈现紫红色，用可见光分光光度计测其吸光度。当被测样品中含SOD 时则对超氧阴离子有专一性的抑制作用，使形成的皿硝酸盐减少，比色时测定管 的吸光度值低于对照管的吸光度值，通过公式计算可求出被测样品中的SOD活 我们测定CuZn—SoD的含量。 4．内皮祖细胞的贴壁率：将经切应力处理后的内皮祖细胞用胰酶消化下 来，收集人工血管中溶液并计算剩余细胞数量。细胞贴壁率(％)=贴壁细胞 总数／接种细胞总数×100％。 5．扫描电镜观察切应力处理前后聚氨酯小径人工血管表面内皮祖细胞 llI 中山大学硕十学位 切应力对种植于聚氯酯小径人TmL管表面内皮祖细胞结构和功能影响的实验研究 对聚氨酯小径人工血管表面以及黏附内