小鼠血清糖蛋白组富集及鉴定.pdf

㈣l 61 讨论………………………………………………………………………………………………．26 结{仑………………………………………………………………………………………………．26 本研究创新性的自我评价·……………………………………………………28 参考文献………………………………………………………………………．29 附录………………………………………………………………………………………………………34 鉴定蛋白列表……………………………………………………………．34 综j丕………………………………………………………………………………………………43 在学期间科研成绩…………………………………………………………58 致谢………………………………………………………………………………………………．59 个人简介…………………………………………………………………．．60 糖基化修饰 疾病如：癌 症、炎症反应和神经退行性疾病密切相关。糖蛋白成为疾病诊断、预后和对于药物治 疗反应的重要靶标。现在得到广泛研究是N．连接糖蛋白和O一连接糖蛋白。已经发现 N．糖基化蛋白质与多种重要的生理过程密切相关(如转化生长因子．pl信号通路和表 皮生长因子信号通路等)，N．糖蛋白的还与多种疾病，特别是癌症相关(如肝癌、胰腺 癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌等)。越来越多的研究表明，监测某些N一糖基化蛋白质的 表达水平变化，较检测这些蛋白质的总体表达水平变化(如AFP)，对疾病诊断具有更 好的特异性和灵敏度。 材料和方法 一、实验对象：选用5只C57小鼠血清混合进行实验。 二、方j．去：对于糖基化肽段的鉴定之前关注的很少，本课题我们关注了N．糖 基化位点血清的分析。对于糖肽富集主要采用肼化学和凝集素的方法进行富集鉴定实 验。肼化学方法是基于肼化学试剂与固相支持物相连接，通过糖苷酶F释放N．连接糖 基化肽段。通过串联质谱鉴定目的肽段。我们应用此方法鉴定血清中分泌蛋白。 结果 我们是用固相萃取N．连接糖肽，是用串联质谱鉴定N．连接糖基化位点。该方法氧 化成醛，它可以固定在一个固相支持糖肽的碳水化合物上。随着肼化学结合串联质潜 分析，在93个蛋白中鉴定到108个糖基化位点。 在本课题中，我们把重点方法大规模鉴定糖肽的方法学。这种方法被称作滤膜辅 肽和亲和捕捉试剂的结合，在超滤管中进行蛋白的消化酶切。然后是由糖苷酶切去糖 肽，是用串联质谱方法鉴定去糖基化肽段。本实验从小鼠血清中得到381个非冗余糖 基化肽段和319糖蛋白。而且这些鉴定到的肽段全部严格含有N—X．IS用．X(其中X为 非脯氨酸)序列，不含有N—X—C或无意序列。 结论 本课题对于血清N一糖基化位点进行深入鉴定糖蛋白质方法是分别使用凝集素和肼 化学方法富集串联质谱。我们鉴定了423个糖基化肽段和348个糖蛋白，建立了小鼠 血清糖蛋白表达谱。我们的策略有以下几个优点：(1)高效的糖蛋白富集策略是鉴定 血清中糖蛋白重要方法。(2)本研究建立的规模化精确鉴定N一糖蛋白质的策略对发现 肿瘤标志物具有重要的应用价值，同时为糖蛋白质组的生物信息学研究提供了宝贵的 基础数据集。 关键词 糖蛋白质组；质谱；凝集素；肼树脂；血清 2 ● 英文摘要论著 ● EnrichmentandIdentificationofMurineSerum Glycoproteome Introduction of most