杜氏盐藻驱动蛋-2亚基FLA8的基因克隆及功能分析.pdfVIP

摘 要 杜氏盐藻驱动蛋白一2亚基FLAg的基因克隆及功能分析 摘要 鞭毛是进化上非常保守的具有特殊功能的细胞器，在细胞运动、感知外界环 境信号并向细胞内传递信号的过程中担任重要角色，其功能和运动性的改变可 导致多种疾病，如多囊肾、肥胖症、糖尿病、癌症等。鞭毛内的物质运输和组 着轴丝向鞭毛顶部的正向运输和方向相反的逆向运输，分别由驱动蛋白 由异源动力亚基组成的复合物，包括三个亚基：两个不同的动力亚基和一个非 动力结合亚基。研究显示衣藻kinesin．2的一个动力亚基FLAl0定位在分裂期的 有丝分裂纺锤体中和分裂间期细胞的鞭毛轴丝外层微管和鞭毛膜之间，FLAIO 基因的突变可以使鞭毛重吸收受到阻碍，衣藻kinesin一2的另一个动力亚基FLA8 与染色体缺失相关，但FLA8对鞭毛再生过程的影响未见报道。 杜氏盐藻(Dunaliellasalina，D．salina)是一种无细胞壁的单细胞真核绿藻， 具有一对等长的鞭毛，长约13 gm，具有典型的9+2结构。显微镜下即可观察到 其鞭毛长度和运动性的变化。本实验以杜氏盐藻为模式生物，以其鞭毛为研究 对象，观察杜氏盐藻FLA8在鞭毛再生过程中的作用，为进一步研究FLA8在鞭 毛组装过程中的作用及鞭毛内运输机制提供依据。 本研究根据团藻、衣藻和小球藻等的FLA8蛋白的氨基酸保守序列 得杜氏盐藻FLA8基因的eDNA全长序列。然后用机械法脱去杜氏盐藻鞭毛，在 鞭毛再生过程中分别收集各时期的藻体，提取细胞总RNA，并反转录得到各时期 Premier 的eDNA，通过Primer6．0在FLA8结构域中设计一对特异性引物，通过 荧光定量PCR分析FLA8基因在杜氏盐藻鞭毛再生过程中的作用。 克隆得到的杜氏盐藻FLA8基因cDNA全长序列为2612 bp，序列分析显示 其包括90 bp的5’UTR、167bp的3’UTR以及2355bp的开放阅读框，编码784 kDa。氨基酸序 个氨基酸残基，其蛋白质的理论等电点为6．65，分子量为85．097 列同源性分析显示其与其他物种有较高的同源性：团藻(73％)、衣藻(72％)、小 摘要 球藻(53％)等，说明克隆所得的序列为杜氏盐藻FLA8的基因序列。实时荧光定 量PCR结果显示杜氏盐藻FLA8 mRNA水平在鞭毛再生过程中持续高表达，在 鞭毛再生速度较快的前3h内，FLA8的表达明显高于其他时间段。本研究显示 杜氏盐藻FLA8基因的高表达在鞭毛再生过程中发挥重要作用。 关键词：杜氏盐藻；FLA8基因：驱动蛋(a-2；鞭毛再生 Abstract andfunctionalofFLA8 ofKinesin·-2 Cloning analysis gene Subunitfrom Dunaliellasalina Abstract are conserved with functions Flagellaevolutionarily organellesspecial playing rolesincell andthe of andtransmission important motility processsignalperception fromexternalenvironmentto defectand are