水淹胁迫下NAPH氧化酶AtrbohD的功能研究.pdf

摘 要 涝害是我国的主要农业灾害之一。涝害可对植物产生水淹胁迫，水淹胁迫则导致植 物缺氧。研究表明，活性氧（ROS）作为信号分子在植物应答缺氧胁迫反应中起重要作 用，然而 ROS 是否参与水淹胁迫，其来源及作用的分子机制如何目前还不太清楚。我 们以拟南芥NADPH 氧化酶基因突变体 atrbohD、转基因植物以及其它缺氧信号转导相 关突变体为材料，利用生物信息学、分子生物学、植物生理学等手段研究发现，NADPH 氧化酶AtrbohD 通过产生H O 参与植物应答水淹胁迫的反应。 2 2 首先，得到了AtrbohD基因的T-DNA插入纯合突变体(atrbohD1、atrbohD2)、超表 达植株及GUS转基因植株。RT-PCR分析表明AtrbohD基因在T-DNA插入突变体中没有表 达。土壤表型分析发现，突变体atrbohD对水淹很敏感，与野生型及超表达植株相比成 活率明显降低。RT-PCR和荧光定量PCR分析表明，在水淹处理下WT植株中AtrbohD基因 的表达量显著增加；突变体植株中乙醇脱氢酶基因（ADH1）（缺氧信号转导的标志基因） 表达明显低于WT 植株，而超表达植株中ADH1 表达量高于WT 植株。另外，对 AtrbohD ::GUS转基因植株进行组织化学定位和GUS活性测定，表明水淹可以诱导 AtrbohD基因的表达，水淹胁迫下突变体幼苗中H O 含量明显低于WT；该基因超表达后， 2 2 缺氧条件下植物产生H O 的量比WT高。这些结果表明，AtrbohD通过产生H O 参与了植 2 2 2 2 物水淹信号转导。 为进一步确定AtrbohD 的作用机制，我们获得了ADH1 基因启动子的GUS 转基因 植株（分别转化WT、atrbohD1 和DN-rop2），水淹后ADH ::GUS 转WT 植株染色有所 加深；而转atrbohD1 和DN-rop2 植株染色几乎没有变化。转AtrbohD 基因启动子的GUS 转基因植株（分别转化 WT、CA-rop2（组成型激活）和DN-rop2（显性负控制）），水 淹后AtrbohD ::GUS 转WT 和 CA-rop2 的植株颜色都加深；而转DN-rop2 植株的颜色几 乎没有变化。ROP2 基因启动子的 GUS 转基因植株（分别转化 WT、atrbohD1），水淹 后ROP2 ::GUS 转WT 及atrbohD1 的植株染色都加深；另外，测定了不同基因启动子的 GUS 转基因植株在水淹后GUS 活性变化，其结果与染色结果一致。利用RT-PCR 和荧 光定量PCR 技术测定水淹条件下基因AtrbohD 缺失及超表达后对ROP2 及ADH1 基因 表达的影响，水淹后ROP2 基因的表达在 atrbohD1 与WT 中明显被诱导，并且随时间 延长表达量逐渐增大。在正常条件下各植株ADH 特异活性与WT 相似；水淹处理下， III WT 和atrbohD 中的ADH 特异活性均增加，但与WT 相比，atrbohD 中水淹诱导的ADH 特异活性受到明显抑制。另外，水淹处理rop2、CA-rop2 及DN-rop2 突变体，rop2、DN-rop2 水淹诱导的 ADH 特异活性受到严重抑制，特别是 DN-rop2 植株随水淹时间延长 ADH 特异活性几乎没有变化。此外，在水淹胁迫下，atrbohD 中H O 含量增加的速度明显慢 2 2 于WT；而且随处理时间的延迟，这种效应更加明显。另外，水淹后突变体rop2、DN-rop2 中H O 增加的速度明显低于WT，而CA-rop2 中的H O 增加的速度比WT 快。AtrbohD 2 2 2 2 基因超表达后，水淹处理后产生H O 的速度显著快于WT。总之，这些结果表明AtrbohD