灰飞虱中与RBDV P10互作的介体因子分析.pdfVIP

摘要 PI 灰飞虱中与船SDvO互作的介体因子分析 摘要 black-streaked 黑条矮缩病毒(Rice virus，RBSDV)为呼肠孤病毒科 dwarf 科植物，引起水稻黑条矮缩病、玉米粗缩病等病毒病，给农业生产造成严重危害。 striatellus以持久循回增殖型方式传播。目前对灰 该病毒通过灰飞虱Laodelphax 飞虱如何传播RBSDV的分子机制尚不清楚。为解析RBSDV与介体灰飞虱的互 作关系，本研究前期以RBSDV的外层外壳蛋白P10为诱饵筛选灰飞虱cDNA酵 母文库，获得了14种互作的基因片段。本论文进一步分析了其中部分蛋白与 RBSDV的互作关系。 为进一步确认互作基因与P10的互作关系，采用酵母双杂交系统分析了互作 基因片段及基因全长与RBSDVP10的互作。结果表明，肌动蛋白(actin)、激活 foractivatedkinase 的蛋白激酶C受体(the C，RACK)、3．磷酸甘 receptor protein 油醛脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate 片段存在自激活作用，原肌球蛋白(tropomyosin，Tm)等蛋白没有自激活作用 且能与P10蛋白互作。为明确互作基因全长与RBSDVP10的互作关系，克隆了 Pvirus)的外壳蛋白CP3的基因全长，采用酵母双杂交系统分析了它们与RBSDV P10的互作关系，结果表明灰飞虱RACK，HiPVCP3能与P10互作，而actin， GAPDH3和Tm不能与P10互作。 此外，为明确灰飞虱actin，RACK，GAPDH3及HiPVCP3这4种蛋白与 RBSDV病毒粒子的互作关系，进一步采用病毒覆盖实验(virus geloverlayassay) 进行了分析。结果表明，这4种蛋白均能体外结合RBSDV病毒粒子。 灰飞虱能传播RBSDV，但不能传播与RBSDV同属的南方水稻黑条矮缩病 riceblack-streaked 毒(South dwarf GAPDH3及HiPVCP34种蛋白是否是RBSDV与灰飞虱互作的特异性介体因子， fluorescence 采用双分子荧光互补(bimolecular 析了这4种蛋白与SRBSDV的外壳蛋白SPl0的互作关系。结果显示，灰飞虱 actin，RACK和HiPVCP3能与SPl0发生互作，表明它们不是灰飞虱与RBSDV 互作的特异性介体因子，可能在介体与病毒互作过程中起着较为保守的作用。 RACK能与RBSDVP10互作，此外RACK还报道能与水稻条纹病毒(Rrice virus，RSV)互作，表明其在灰飞虱传毒过程中有重要作用。为进一步探 stripe 摘要 究RACK在灰飞虱传播RBSDV过程中的可能作用，本研究分析了不同龄期灰飞 5龄灰飞虱中，2龄灰飞虱RACK基因的表达量最高。2，3，4和5龄灰飞虱RACK 的表达量分别是1龄的4．2倍，1．5倍，1．5倍和1．0倍。灰飞虱感染RBSDV后， l龄灰飞虱RACK表达量上调了1．7倍，而2，3及4龄灰飞虱RACK表达量分别 下调了0．4倍，O．4倍，O．5倍。以上结果表明，在2，3，4龄灰飞虱中，RACK 的表达随着龄期的增加而下降，而且RBSDV的侵染能抑制灰飞虱RACK的表达。 为进一步分析灰飞虱原肌球蛋白Tm在病毒与介体互作中的作用，本研究克 隆了Tm编码基因的全长ORF，并将其连接至原核表达载体pET-32a，在大肠杆 菌BL2l中进行了原核表达，纯化获得了Tm蛋白，并制备了多克隆抗体，为深 入研究灰飞虱Tm蛋白在传播RBSDV过程中的作用奠定了基础。 关键词：RBSDV；灰飞虱；互作蛋白