临床肿瘤标本中异miRNA的检测及mir-200b功能研究.pdfVIP

中文摘要 临床肿瘤标本中差异miI矾A的检测及mir-200b功能研究 博士研究生：夏伟 导师：邵宁生研究员 摘 要 miI州A是一类长约22个核苷酸的非编码小RNA分子，以转录后调节的方 式改变靶基因的表达水平。miI埘A通常由I斟A聚合酶II转录生成pri-miRNA， 子的作用下转运出核，在细胞质中由Dicer等加工为成熟的miRNA，最后成熟 用于特异mlⅢA的3’UTR从而抑制翻译过程的进行或直接降解mIⅢA。 miI矾A在肿瘤的研究中起着重要作用：首先，mi对峨的表达具有显著的组 织特异性，在不同的人类肿瘤中，几乎所有的miRNA都表现出了不同的表达状 态，mi鼢、『A表达谱分析可用于鉴定肿瘤的发育起源，对肿瘤进行分类。相较于 基于mRNA表达谱的分类方法，miI斟A表达谱分析具有更高的精确度，能够更 加直接的反映基因功能水平。同时miRNA表达谱作为稳定可靠的生物标志物， 也可用于肿瘤的诊断及判断预后。其次，miRNA功能多样，几乎参与了每一个 重要的生命过程，包括增殖，凋亡，分化，代谢等等，在肿瘤的发生发展过程中 起着关键作用。研究表明，miRNA表达水平的改变可以引起一系列癌基因和抑 癌基因的变化，通过寡核苷酸类物质特异性抑制致癌miRNA的活性，或过表达 具有抑制肿瘤作用的miRNA，可能对肿瘤的治疗提供新的思路和有效途径。第 三，肿瘤的发生发展是多因素、多步骤、多基因参与的复杂过程，涉及基因众多， 对miRNA的研究有助于系统性研究基因间的相互作用及肿瘤发生发展的分子机 制，为肿瘤的预防、诊断和治疗提供帮助。 本研究选用膀胱癌，子宫内膜癌，肺鳞癌及肺腺癌的临床标本及其癌旁组织， 分别提取总RNA后利用miRNA芯片技术检测各组癌及癌旁组织差异miRNA， 并选择其中有代表性的miRNA进行具体的功能研究，同时对miRNA靶基因寻 找方法进行了探索，建立了以mlⅢA质核比为基础的靶标寻找方法。本论文的 主要研究内容包括：①不同肿瘤临床标本中miIⅢA的表达谱分析；②mir-200b 功能研究；③miRNA寻靶策略的建立。本研究所获得的具体结果如下： l、不同肿瘤临床标本中miI斟A表达谱分析。通过miRNA芯片技术对膀胱 癌、子宫内膜癌、肺鳞癌及肺腺癌的临床标本及其癌旁组织中的miIⅢA表达情 ．4． 中文摘要 况进行分析，每组肿瘤标本均得到几十条具有显著性表达差异的miRNA，其中 mir-29，mir-125，mi卜15，mir．16等在四种不同肿瘤中均存在显著差异。 2、mir-200b功能研究。通过表达谱分析得知在子宫内膜癌及其癌旁组织中， 入不同的肿瘤细胞系。在HeLa细胞中过表达mir-200b后，细胞能够更快速地通 过G1期进入S期，而在生物信息学软件预测的mir-200b的靶基因中，我们发现 对帕3能够影响细胞周期的进程并具有使细胞停留在Gl期的能力，因此我们推 测l心D3为mir-200b的靶基因。我们将I心『D33’非翻译区上mir．200b的靶位点 克隆到荧光素酶报告载体中，重组载体与mir-200bmimic共转染后发现荧光素酶 活性发生明显下降，而将两个靶位点分别突变掉后荧光素酶活性回复到正常水 平，证明mn200b可以与I心m33’非翻译区上两个靶位点可以发生特异性的结 合。同时利用荧光定量PCR实验与免疫印迹实验证实了mir-200b可以在mRNA 水平和蛋白水平上抑制附呵D3的表达，l心m3确为mir-200b的靶基因。接下来 通过与l心D3的siRNA进行比较我们发现，I心ID3的表达被抑制后，其下游分 子CCNDl的表达量增加，进而使HeLa细胞快速通过Gl期进入S期。在膀胱 癌细胞系T24中过表达mir-200b后，细胞形态发生明显改变，细胞失去伪足样 突起，形状变得不规则，同时划痕修复实验证明转染后的细胞迁移能力下降。在 生物信息学软件预测的mn200b靶基因中，WASF．3能够影响细胞迁移，我们利 用荧光定量PCR实验和免疫印迹实验证明mir．200b能够在T24细胞中抑制 发现，mir