乌鳢性别相关的mrt基因的克隆及其组织表达特征.pdfVIP

  Classified Index: CODE:10075 U.D.C: NO A Dissertation for the Degree of M. Agriculture Molecular cloning and expression analysis of Dmrt gene in relation to sex in Channa argu Candidate: Zhou Nan Supervisor: Prof. Kang Xianjiang Academic Degree Applied for: Master of Science Specialty: hydrobiology University: Hebei University Date of Oral Examination: June, 2014 摘  要    摘 要 近年来随着养殖业的需要，乌鳢（Channa argu ）逐渐成为国内的特种养殖品种。 为提高乌鳢子代雄性率及开展乌鳢的单性养殖，本研究采用 RT-PCR 和 RACE 的方法克 隆出了乌鳢的 Dmrt1 基因和 Dmrt4 的部分基因，并对 Dmrt1 的表达特性进行了具体的 分析，这将有助于了解乌鳢的性别决定机制。 Dmrt 基因是涉及到性别决定和分化的保守基因家族，它广泛存在于不同物种中。 本研究通过使用简并引物从乌鳢的基因组DNA 中获得了Dmrt1 的保守域DM1 及Dmrt4 的保守域DM4 ，对DM 结构域进行测序，通过比对确定为Dmrt 基因的保守域。根据获 得的保守域序列，设计 3’RACE 和 5’RACE 的引物，采用RACE 的方法扩增Dmrt 的全 长 cDNA 。 在乌鳢的精巢组织克隆得到乌鳢 Dmrt1 基因的 cDNA 序列，并采用半定量和定量的 手段对 Dmrt1 mRNA 在乌鳢成鱼中不同组织的表达差异进行分析。研究获得的乌鳢 Dmrt1 基因 cDNA 全长为 1573 bp，5’端非翻译区 25 bp ，编码266 个氨基酸的 800 bp 的 开放阅读框，747 bp 含有脊椎动物典型的多腺苷酸化加尾信号 AATAAA 的 3’端非翻译 区。通过对氨基酸序列的同源性进行分析表明，乌鳢 Dmrt1 基因与多种鱼类相似度较高， 与其他类动物相似度较低 。氨基酸序列与银鳕鱼、黑棘鲷等鱼类同源性较高，并与之 共同聚为鱼类的 Dmrt1 分支。RT-PCR 和实时定量结果均表明 Dmrt1 在雌雄乌鳢的 10 个样品中，在精巢中表达量最高，相对较弱地在卵巢中表达，在其余组织中 Dmrt1 基因 的表达量很少。以上实验结果表明，Dmrt1 基因可能跟性腺及生殖细胞的发育有关联。 在乌鳢的卵巢组织中克隆出了乌鳢的 Dmrt4 基因的部分序列。Dmrt4 基因通过 5’ 端扩增，并分别得到 192 bp 的特异性条带。经过与保守域DM4 进行拼接，已经得到332bp 的片段。对保守域DM4 进行分析，可以看出虽然碱基序列有较大差异，但是编码的氨 基酸序列相似度非常高。我们可以看到，Dmrt4 的进化是高度保守的，表明此基因在性 别分化和功能的维持上可以发挥重要作用。 关键词 乌鳢 Dmrt1基因 Dmrt4基因 基因克隆 表达特征 I