五氯酚对稀有鮈卵黄蛋白原和热应激蛋白诱导效应的研究.pdfVIP

捅 婴 五氯酚对稀有绚鲫卵黄蛋白原和热应激蛋白诱导 效应的研究 生物化学与分子生物学专业硕士研究生熊力 指导教师刘堰教授 摘要 环境内分泌干扰物(EnViro姗entaJ朗doc血e 常机体的内分泌系统从而影响生物体生长、发育、繁殖等生命活动，已成为关系到 境内分泌干扰物之一．它作为一种高效廉价的杀虫剂、木材防腐剂及除草剂曾在世 界范围内广泛使用．其在中国长江中下游11个省、市、自治区被大范围、长时间 地用作杀灭钉螺和控制血吸虫病，最终进入水体生态系统对水环境造成持久性污 染．PCP具有较强的致癌、致畸、致突变作用，对生物体的生殖系统影响较大．PCP 对生物体的内分泌干扰作用日益明显，但对其雌激素效应一直存在异议，且PCP 内分泌干扰作用具体的分子机制及其可供检测的敏感分子生物标志物研究均较少． 稀有绚鲫为中国所特有的水生模式生物，与斑马鱼等相比具有更好的敏感性和实 验重复性，是进行化学品毒性测试和环境水样毒性实验的理想材料．因此，本研究 选择稀有觞鲫为研究对象，采用水体暴露的方式，分别从组织、蛋白、基因水平研 究PCP对其卵黄蛋白原的诱导效应以彻底揭示PCP的雌激素效应及其作用机 制；同时通过研究PCP对稀有胸鲫热应激蛋白的诱导效应以筛选敏感、准确的分 子生物标志物，对PCP进行有效的监测．研究内容主要包括以下部分： 1．为研究VTG在稀有绚鲫不同组织器官的表达分布情况，以及PCP暴露 对不同组织中vrG表达分布的诱导作用，采用半静态水体暴露的方法，将成年 雌、雄稀有觞鲫及幼鱼分别暴露于空白对照组，DMS0溶剂对照组．16、80、160 EE2阳性对照组中14、2l、28d．先利用免疫组化法 甥·L“PCP处理组，50ng·L．1 检测空白对照组中稀有晌鲫幼鱼和雌、雄鱼体内肝脏、肾脏、脾脏、肠、性腺、 大脑、肌肉组织中VTG蛋白的表达分布情况，研究发现VTG蛋白在稀有绚鲫肝 脏细胞中合成，通过血液循环到达其他组织；VTG蛋白只在稀有鲷鲫雌鱼肝脏、肾 脏、脾脏、肠组织中有分布，而在其幼鱼和雄鱼各组织中均未见分布．再利用免疫 组化检测PCP和EE2暴露对稀有觞鲫幼鱼和雄鱼肝脏、肾脏、脾脏、肠、性腺、 大脑、肌肉组织中vTG的诱导表达情况，研究发现PCP和EE2暴露均能诱导 雄鱼和幼鱼肝脏、肾脏、脾脏、肠组织中出现VTG蛋白分布，但PCP效应远弱 于EE2，并且其肝脏组织中VTG蛋白的分布与PCP暴露呈浓度效应和时间效 两南大学硕十学伊论文 应．结果表明稀有绚鲫幼鱼及雄鱼各组织中VTG的非正常表达分布可以应用于 环境雌激素的检测，从组织水平验证了PCP具有雌激素效应． 2．采用肝脏组织匀浆和收集血清两种方法结合ELISA技术准确检测不同浓 嵋·L-1PCP暴露2ld能够显著诱导雌雄稀有觞鲫肝脏和血清中VTG蛋白含量， 并具有显著浓度效应(PO．01)．结果表明稀有觞鲫肝脏组织匀浆结合ELISA方 法同样可以准确检测PCP的雌激素效应．稀有觞鲫ⅥG蛋白可以作为PCP检 测的分子生物标志物，从蛋白水平说明PCP具有雌激素效应． 3．为了解PCP雌激素作用的机制。利用Real．timePCR检测8、16、80、160 PCP暴露21 Ug·L-1 d对稀有绚鲫雄鱼和幼鱼肝脏中雌激素相关关键基因(ER仅、 I、ⅥG ERBl、ERB2、VTGII)表达的影响．研究发现，不同浓度PCP均能抑制 因mRNA的表达(P0．01)．同时PCP和EE2都显著诱导VTGI、ⅥGII基 通过调节不同ER基因的表达，进而诱导VTG基因的表达发挥雌激素效应，从 基因水平揭示PCP具有雌激素效应． 70和 4．利用简并引物和RT．PCR技术从稀有绚鲫肝脏中克隆得到HSP HsP 90基因序列片段．HSP70基因片段为1783 bp，编码594个氨基酸，提交