同步辐射圆二色光谱学与研究生物大分子结构与功能.pdf

摘要 摘要 本论文主要利用同步辐射真空紫外圆二色(SRCD)光谱学方法，结合动态光 散射(DLS)、X射线晶体学以及原子力显微镜(AFM)等实验方法研究了溶液条件 下生物大分子的结构与相变：(1)原发性痛风病人体内磷酸核糖焦磷酸合成酶 N 响；(3)丝素蛋白重链N端亲水[K(Fib．Hdomain)的结构与功能的关系。在二 级结构分析的基础上，分别探讨了点突变导致PRSl超活性的机理、ATP促进溶 N 菌酶形成淀粉样纤维的机制以及Fib．Hdomain在自然纺丝过程中发挥的作用。 l、点突变导致PRSl超活性的机理 本工作表达纯化了PRSl及D52H、N1 六个致病点突变体，酶活性测试显示点突变导致酶活性显著升高。利用SRCD、 DLS等方法研究了它们在结合底物、抑制物前后构象与聚集状态的变化。研究 发现PRSl蛋白的活性形式并不依赖于其聚集态，但是底物ATP能够引起PRSl 聚集成六聚体。抑制剂ADP结合位点位于六聚结合界面上，所以六聚的形成为 ADP进行别构抑制调控提供了结构基础。这一复杂的酶活性调控机制使得酶催 化活性处于正常水平。当PRSl发生点突变时，其聚集能力被显著弱化，有的点 能力。而且SRCD研究发现点突变导致蛋白底物结合构象改变，晶体结构分析揭 示N1 14S底物结合构象的改变可能会破坏P043-别构位点。所以点突变导致的底 物结合构象的改变也许是酶超活性的另一个原因。这些因素一起导致酶出现超活 性，最终引发痛风。 2、ATP促进溶菌酶形成淀粉样纤维的机制 利用AFM、SRCD、DSC等方法研究了聚阴离子ATP对溶菌酶溶液构象、 解折叠过程以及淀粉样纤维形成的影响。研究发现ATP可以结合到溶菌酶上， 而且ATP磷酸基团的强烈静电效应使得溶菌酶上暴露的色氨酸残基卷入更加疏 水的环境，从而改变了蛋白质的二级结构。在升温解折叠过程中，色氨酸残基位 置的改变降低了溶菌酶的热稳定性，导致了二级结构的非协同性展开，在500C 左右产生了一个含有相对丰富螺旋和较少伊片结构的部分展开中间体。DLS实 验说明部分展开中间体相比于天然结构具有更强的聚集倾向。此外，ATP非特异 性结合到伸展的多肽链上，屏蔽了相应的反应基团，抑制了溶菌酶展开过程的可 逆性。因此ATP诱导的溶菌酶的不稳定和非协同性展开，是ATP促进溶菌酶形 成纤维状结构的内在基础。同时也表明，相比于单体的富伊片中间体，淀粉样纤 维片段的变性程度才是纤维形成的关键因素。 摘要 Ndomain 3、Fib-H fiN)的构象转变 利用SRCD方法研究了四个不同长度的不含信号肽(1~21位残基)区域的FN 片段，即FN(22．71)、FN(22．104)、FN(22—126)幂11FN(22．145)，在不同溶液条件下 验手段，发现在能够形成伊片结构的溶液条件下，这些FN片段能够形成直径为 50．100 nlrl的纳米球状或者纳米囊泡状结构，而且这些纳米球状结构可以互相融 合形成不规则的网状结构。并且发现FN片段越长越容易发生构象转变和形成纳 domain除了 米球状结构。相比于丝素蛋白重链中大量的疏水重复区段，Fib．HN 增加蛋白溶解度的功能外，可能扮演着一种感受器的角色，能够迅速感知周围环 境改变的信号，从而引起整个丝素蛋白重链的构象变化。这些纳米球状结构的自 组装可能作为一个种子启动整个丝素蛋白重链形成纳米原纤维，从而表现出家蚕 丝纺织过程中重要的形态学特征。 关键词g同步辐射真空紫外圆二色二级结构 痛风磷酸核糖焦磷酸合成酶 点突变三磷酸腺苷溶菌酶解折叠丝素蛋白 构象转变 Abstract Abstract Thisthesis the onthestructureand presentsinvestigation transitio