猪支气管败血波氏杆菌皮肤坏死毒素基因的原核表达间接ELISA检测方法的初步建立.pdfVIP

猪支气管败血波氏杆菌皮肤坏死毒素基因的原核表达及间 接ELISA检测方法的初步建立 摘要 由支气管败血波氏杆菌(肋础右eJ如妇∞幽js印芒jc马Bb)引 起的非进行性猪萎缩性鼻炎被认为是一种重要的上呼吸道疾病。该病 可导致育肥猪生长迟滞，降低饲料的利用率，给世界畜牧业造成巨大 的经济损失。其主要的临床症状为：鼻炎、鼻甲骨萎缩和颜面变形等。 据报道，Bb和其菌相有致病性关系，其中强皮肤坏死毒素 (dermonecrotic toxin，DNT)在I相菌中的毒力是最强的，具有不耐 热的短鞭毛和荚膜，毒力比其他相菌的都强。该毒素是一种很主要的 致病因子，由DNT基因编码，在这个菌的致病过程中起着非常重要的 作用。 本研究针对Bb的DNT基因及其表达的产物开展了以下的工作： 参照GenBank上已经发表的DNT基因序列，设计了三对引物，以 本实验室分离并保存的Bb菌株为实验材料，用PCR等方法分三段克 隆了Bb的DNT基因，再连接成与目的相符的全毒素基因。接着对全 毒素基因序列进行测定。还选择PET高效原核表达系统，构建了重组 表达质粒PET—DNT。结果显示：目的基因有4395bp左右，同GenBank 相比，核苷酸的同源性达到99．2％以上。表明该基因不存在地域性 的差别。同时表明dnt全毒素基因是十分保守的。 接着将分段扩增的产物插入原核表达载体PET一28a中，成功构建 及酶切鉴定等方法，均能得到基本与理论相符合的基因片段，表明这 三个原核表达载体构建成功。研究二，将重组质粒“PET—DM。’’转化 到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，经诱导获得大小约33kDa的表 达蛋白(rDNT。)。 以DNT基因5’端亚克隆表达产物rDNT。为抗原，初步建立一种 间接ELISA方法，目的是检测DNT抗体。用多次方阵滴定的方法来确 定抗原的最佳包被浓度，最后确定为1．6垤／ml、关于血清的最佳稀 释倍数也用相同方法，为1：100，阴阳分界为OD。30=O．313：该方法初步 检测了266份临床送检样品，结果表明阳性率达到31．2％． 为了能更好的研究毒素蛋白的一些生物学活性，通过健康豚鼠的 皮肤坏死试验来研究表达蛋白的生物学活性。结果显示：表达产物和 blot的结 天然毒素相比较，DNT的皮肤坏死活性前者较低。Westem 果则表明表达产物反应原性是良好的。 4395 本研究成功地克隆并表达了Bb菌株毒素DNT bp基因及克 隆了5’端879bp基因，并将表达的产物作为抗原初步建立一种间 接ELISA方法，目的为检测DNT抗体，为日后AR的检测方法提供了 新的思路． 关键词：猪支气管败血波氏杆菌克隆测序原核表达生物学特 性皮肤坏死毒素基因(DNT)间接ELIsA Ⅱ PROKARYOTICE)PRESSl0NOFDNTGENEFOR BORDET王见LABRONCHISEPTICAINSⅥ，][NEAND AN ELISA ELEN匝NTARYDEVELOPⅣ匝NTOF INDERECT ASSAY AB STRACT Bordetella bronChis印tica(Bb)is肌Ve哆inlpon￡mtp砒ogenic bacteriulmauldcanresultsiIlclⅡ．0nic甜1dacute disease．The respiration diseaSecancause utilization．Givettle