转基因水稻Bt汕优63外源插入结构验证和定量检测方法建立.pdfVIP

摘 要 我国对转基因水稻的研究处于世界领先水平，其中，研发的一些抗病、抗虫转基因水稻品系 已经进入申请生产种植用生物安全证书阶段，但由于它们的转基因生物安全问题等一些原因，至 今尚未有品系批准商业化生产应用。而分子特征分析是对转基因作物进行生物安全性评价的一个 重要方面。我国和国际上许多国家的转基因生物安全管理法规都有这方面的资料要求。因此，本 研究以尚未进入商业化生产的转基因水稻“历汕优63”为研究对象，利用普通PCR、长链PCR、 反转录PCR和荧光定量PCR等方法，从其DNA水平、RNA水平进行研究，主要研究内容和结 果有以下四个方面： 1． 验证了基因枪转化的转crylAb／c融合基因水稻品系“夙汕优63’’的外源插入DNA的 结构，证明其确实有部分标记基因片段存在。验证了其转化事件定性检测体系。并检 测了其自交产生的下一代植株的外源插入结构，发现标记基因部分片段依然存在，外 源基因的分离比符合单位点的孟德尔遗传。 ’乙 根据侧翼序列优化设计特异性引物，以转基因水稻种属特异性基因作为PCR扩增的内 源参照，建立转化事件特异性定量检测体系。结果表明，定量体系具有较好的重复性， 用标准分子确定的转基因水稻“历汕优63”的检测极限为100个拷贝数。 3． 利用RT-PCR的方法检测了转基因水稻“研汕优63”整个生育期外源标记基因、目的 基因在mRNA水平上的表达情况，检测结果显示，外源标记基因在整个生育期没有表 达，目的基因稳定表达。在此基础上，建立目的基因在mRNA水平上表达的定量检测 体系。实验结果表明，定量体系重复性较好，苗期目的基因表达的量较少，其他生育 期目的基因稳定表达。 4． 以标准分子作为定量PCR外部标准品并建立标准曲线。本文利用重组PCR的技术构 建了标准分子，检测含有转基因成分的混合样品，根据标准曲线计算转基因成分的含 量：区分转基因水稻“夙汕优63”与“华恢1号”样品；以构建好的标准曲线检测目 的基因在mRNA水平上的表达量。结果表明，以标准分子作为定量标准品的检测结果 具有较好重复性和再现性，重组PCR技术用于构建标准分子是可行的。 本文的研究内容通过对转基因水稻历汕优63外源插入结构的研究，成功建立了针对转基因 水稻成汕优63转化事件特异性PCR定量检测方法，望为转基因水稻的监管提供技术支持，为今 后我国转基因作物及其产品检测标准的制定，转基因作物及其产品的定量检测试剂盒的开发提供 技术支持。建立了目的基因crylAb／c在转录水平mRNA表达的定量检测体系，这将为准确、高 速的检测转基因水稻历汕优63目的基因在转录水平上表达及其相关标准的制定和其安全性管理 提供参考依据。 关键词： 转基因水稻“历汕优63” 检测转化事件特异性PCR目的基因表达 Abstract riceofChinain disease-resistantand Transgenic iS theworld’Sadvancedlevel．several insect-resistantrice for certificatesto lineshavebeenintothe of transgenic safety stageapproval commercial of hasnot dueto considerationsthem,it applications．Butmainly safety approved commercial