特异性抗体定量检测葡聚糖方法和研究.pdf

特异性抗体定量检测葡聚糖方法的研究 摘 要 在甘蔗制糖工业中出现的葡聚糖主要为a．葡聚糖(又称右旋糖酐，以 下简称葡聚糖)，是肠膜明串珠菌属产生的葡聚糖蔗糖酶将蔗糖转化为a．D 吡喃葡萄糖(主要是a一(1—6)结构的葡萄糖)高分子聚合物多糖，其对 制糖生产有较大影响，产生增大糖液的粘度，降低沉降速度、糖液的过滤 性，使蔗糖结晶时生成异常形态的晶体等问题，因此，葡聚糖的实时监测 成为糖厂生产控制的一个重要技术。目前，葡聚糖检测的主要方法是有着 检测过程操作繁琐、检测时间长、检测结果准确度较低以及不适用于不同 糖品等缺点化学分析方法。因此，建立一种方便快速、准确度高，稳定性 好、适用于各种样品中葡聚糖的检测方法势在必行。本论文研究简便、快 速、准确、价格合理的免疫学方法来测定葡聚糖的含量，使之适用于甘蔗 制糖工业生产中的各种糖品中葡聚糖，对整个生产线中葡聚糖含量进行实 时监测，为提高生产管理效率提供依据。主要研究内容和结果如下： (1)利用己制备好的抗葡聚糖单克隆抗体杂交瘤细胞，接种到Balb／C 小鼠腹腔内，产生含抗葡聚糖单克隆抗体腹水；收集腹水，经纯化后得到 纯化抗体；摸索其冻干条件，进行稳定性试验，为葡聚糖免疫学检测国产 试剂盒中抗体的保存打下基础。结果表明：通过纯化，抗体纯度可达到95 ％以上，葡聚糖特异性抗体的最佳冻干保护剂是浓度为lO％的蔗糖，冻干 后．20℃保存360天抗体效价变化不大。 聚糖的方法，探讨了不同分子量葡聚糖、反应时间对各自标准曲线测定的 影响。结果表明：两种方法的标准曲线均受葡聚糖分子量大小的影响，葡 聚糖分子量大时影响较小，葡聚糖分子量小时，影响较大：最佳反应时间 糖T．500线性范围、检测下限、分辨率、准确度及重复性等参数。并对白砂 糖、原糖、蔗汁样品进行加标回收及重复性试验。结果表明：当蔗糖浓度 糖液重复性RSD=0．84％，标准品糖液加标平均回收率为95．5％，检测部分 1．9～ (％)=O．52％，平均加标回收率为99．9％，检测结果与标准品糖液高度一 致。总的来说免疫比浊法要优于《原糖》(GBl5103．2006)国标法。 (3)研究抗体用量少的免疫比色法反应时间和加样量，探讨样品颜色 对反应结果的影响，并确定其线性范围、检测下限、精密度和重复性等参 数，之后又对白砂糖、原糖、蔗汁样品进行加标回收及重复性试验。结果 u u 表明：最佳反应时间13min、100L抗体最佳加样量1L，检测葡聚糖T．500 =98．2％，略低于免疫比浊法，部分样品重复性平均相对标准偏差RSD(％) =O．56，另外两种样品加标回收试验的平均加标回收率(％)=98．6％，说明 样品测定与标准品糖液高度一致。因此利用酶标仪的免疫比色法延续了免 疫比浊法准确度高及重复性好的优点，但是其最低检测限太大，对葡聚糖 浓度比较低的样品检测不灵敏，该方法用于测定低浓度样品时有待于进一 步改进。 (4)选定免疫比浊法对甘蔗糖厂生产线上在制品、成品及副产品中葡 聚糖含量进行测定并加标回收。同时采用免疫比色法测定同样样品，比较 两者测定结果。结果表明，免疫比浊法与免疫比色法测定结果基本一致。 关键词：Q．葡聚糖(右旋糖酐)葡聚糖单克隆抗体纯化冻干 《原 糖》GBl5108．2006国标法免疫比浊法免疫比色法 II STUDY0F DETECTIONMETHODSFOR QUANTITATIVE DEXTRANBYSPECIFICANTIBoDIES ABSTRACT Inthe cane naturaldextranoftenmeans sugar industry，the named referred as isacommonname fol