抑癌基因pte在原始卵泡启动生长中的作用及机制.pdf

摘要 摘要 目的： 本课题拟通过原始卵泡体外培养模型，探究调控原始卵泡启动生长的重要 基因pten在原始卵泡的表达；利用携带pten．shRNA慢病毒载体转染离体卵巢， 观察pten下调对原始卵泡启动生长的影响，进而探讨pten在原始卵泡启动生长 中的作用及机制。 方法： 1．无菌条件下获取2日龄SD雌性大鼠卵巢，分别在Waymouth培养体系 中培养0、4、8天。采用HE染色法观察0，4，8天卵巢中原始卵泡的表达和数量 mRNA在原始卵泡的表达；采用免疫组化法观察0,4，8 变化：采用PCR法观察pten 天卵巢中PTEN蛋白在原始卵泡的定位和表达。 2．有效干扰片段的筛选，pten．shRNA慢病毒的包装，选择最佳感染时间和最 blot法 佳感染复数(MOI：感染时病毒和细胞数量的比值)，应用RT．PCR和western 验证pten．shRNA慢病毒基因沉默效率。应用荧光显微镜观察GFP表达变化，并 放射免疫检测0，4，8天培养液中激素含量的变化。 应用HE染色法观察各处理组原始卵泡启动生长发育，用RT．PCR法观察 blot观察PTEN蛋白的表达变化及信 ptenmRNA的表达含量的变化，用western 号通路P13K蛋白的表达变化。 结果： 1．原始卵泡数在卵泡总数中的比例随着培养天数的增加而减少；ptenmRNA 在原始卵泡中有表达，随着卵泡的发育表达强度逐渐减少；PTEN蛋白在0，4，8 天组原始卵泡中均有表达，表达部位由卵母细胞胞浆转向颗粒细胞胞浆，随着 卵泡的发育表达量逐渐减少。 2．Pten．shRNA慢病毒感染后，最佳感染时间为卵巢取出后的36h，最佳感染 mRNA和PTEN 法检测，与对照组相比，原始卵泡数占卵泡总数的比例降低，pten 摘要 蛋白表达量明显下降。Pten．shRNA慢病毒感染后的培养液中雌激素含量降低， 孕激素显著降低。 mRNA表达变化不 3．加入P13K抑制剂LY294002后，与空白组相比，pten 明显，原始卵泡数占所有卵泡总数的比例升高，原始卵泡发育受抑制。 Pten．shRNA慢病毒感染后，用westernblot观察PTEN蛋白表达在8天正常组比 O天正常组下降，8天最佳干扰组比8天正常组下降。P13K蛋白表达在8天最佳 干扰组比8天正常组下降。 结论： 1．Pten mRNA在原始卵泡中有表达，PTEN蛋白的表达量随着原始卵泡启动 生长而降低。 2．Pten—shRNA慢病毒转染后，原始卵泡数量减少，促进了原始卵泡的启动 生长。 3．抑癌基因pten通过P13K信号通路对原始卵泡的发育起作用，其上下游 关系可能是pten--．P13K：还可同时通过卵泡细胞分泌的孕激素对原始卵泡的发 育起调控作用。 关键词：pten：原始卵泡：慢病毒；RNA干扰；启动生长 ★本研究工作受国家自然科学基金(81 160081)、江西省自然科学基金 (2010GQY0214，201 14BAB205009)、江西省教育厅科学技术研究项目 13 (GJJ09431，GJJl 13)。 ABSTRACT objective： This tobeof folliclesinvitro topic primordial culturemodelto the