新的编码β-葡糖苷酶的基因的克隆、表达及表达产物的酶学特性分析.pdf

新的编码13一葡萄糖苷酶的基因的克隆、 表达及表达产物的酶学特性分析 摘要 本研究利用p一葡萄糖苷酶的活性筛选策略，对课题组前期构建的碱性 污染土壤样品的宏基因组文库AL01进行筛选，得到了一个表达p．葡萄糖 苷酶活性的阳性克隆pGXAG805。对其进一步亚克隆和序列分析，获得两 个可能编码新型13．葡萄糖苷酶的基因的开放阅读框，分别命名为： 葡萄糖苷酶基因没有任何相似性。在氨基酸水平上，BgllD与其他糖基水 解酶蛋白的相似性很低，与来源于弗兰克氏细菌的糖基水解酶家族3的蛋 白有25％的相似性；BgllE和来自嗜热网球菌的一种属于糖基水解酶蛋白质 UWl01 的一种扁桃体消旋酶蛋白有29％的相似性，和来自嗜热网球菌的一种6．磷 酸式．p．葡萄糖苷酶有39％的相似性。 BL2 1(DE3)，得到重组菌株pGXAG801、pGXAG803，在含有柠檬酸铁铵和 七叶苷的LA平板上均能表现出p一葡萄糖苷酶活性。 编码产物经镍柱纯化后，以pNPGIu为底物，对其进行了酶学性质的初 可能为0．54mmol／L；Vmax可能为2．01 I．tmol／min；最适条件下酶活可能为 4．91 Ba2+、Fe3+离子有抑制作用；高浓度葡萄糖对酶活有抑制作用，抑制常数可 能为62．2mM；半衰期可能6 o 7 mmol／L；Vmax可能为4．1 C；Km可能为2．12 lamol／mim最适条件下酶 活可能为6．12 h。 萄糖对酶活有抑制作用，抑制常数可能为47．1mM；半衰期可能为14 本工作一方面从生物信息学角度预测了基因bgllD，bgllE可能是编码 新型糖基水解酶家族的种子，另一方面从基因的克隆、表达及表达产物的 酶学性质分析角度验证了生物信息学的预测，为构建一种新型的糖基水解 酶蛋白质家族打下坚实基础。 关键词：p．葡萄糖苷酶糖基水解酶家族宏基因组文库 II I ONl I ONANDENZYMATI CPROPERTI ESOF C NG．EXPRESS NOVEL13-GLUCOSI DASEGENES ABSTRACT Basedon a AL01 fromalkaline constructing library soil，a metagenomie clone wasobtained positive13-glucosidasepGXAG805 using this wassubclonedandfurther in screeningstrategystudy．pGXAG805 analysed in resultshowedthatthereweretwo frames sequence，the possibleopenreading fornovel werenamedas and p-glucosidase，whichbgllDbgllE．