泛素羧基末端水解酶在卵母细胞成熟过程中作用机制的初步的分析.pdf

尘塞盔差兰圭兰焦逢茎 泛素羧基末端水解酶在卵母细胞成熟过程中作用机制的 初步研究 摘要 ／ ， (中华大蟾蜍的卵母细胞长足以麝，停滞于第一次减数分裂(MI)的早 vesiclebreakdown． 期，谯孕酮的诱导下启动成熟过程，生发泡破裂(germinal GVBD)，著停滞于第二次减数分裂的中期。人_I阻断中华大蟾蜍的正常冬 鬣，在离温(28℃)条彳串下饲养2．3个胃，爵蔽学致长避静辩母维稳失去在 孕酮诱导下发生GVBD的能力，即失去成熟潜能。这种丧失成熟潜能的卵 母细胞称为高温卵，而经历冬眠并具成熟潜能的蟾蜍的卵母细胞，称为低温 卵。本实验室过去的工佟i}为了探讨影响卵母细胞成熟潜能的原因，利用针 对多葶孛卵母细胞蛋白的单抗，分别进幸亍卵母细胞内显微波射实验以分析其阻 凝孕溺诱导的磐母缨腿成熟豹生物效应，结果表明一耪分子鬟为28kDa的蛋 院较发现，p28属予泛素羧鼙末端承解酶(ubiquitincarboxyl．terminal L1的亲缘关系鼹近。 hydrolase，UCH)家族，和UCH 本文在过去的工作基础上进一步研究了p28在卵母细胞成熟过程中的 作用钒刳。农太肠抒慧(DE3)中表达了貉胱甘欺转移酶融合蛋I皇(GST—p28)， 并周凝蠢酶甥下p28部分；透过耀针对天然站8拣肇克隆技体检测，发现重 的活性鍪定实验。国了验证p28确实其有UCH活健，含戒并纯纯■UCH 经典底物泛索乙基酩(ubiquitinethyl 2 省銮盔塞兰圭警警燕兰 钝承瓣居经裹效液魍色谱(HPLC)分辑蜘方法鉴定。在太肠抒麓中重缎表 应产物的含爨，结栗表明p28其有鳃显的UCH活性，爵雨，p28命名串华 大蟾蜍泛素羧基采端水解酶(toadUCH，tUCH)。 Western分极表明，朱成熟卵母细胞和成熟卵母细胞的可溶性蛋白 中均禽京p28，约占提取物中蛋囱质总量豹2％。制餐了p28的照性失 活突变型，研究发理Cys90不仅参与决意UCH懑惶，还影嗡痣物结合 L1对底物Ub．AMC抟 能力。根据测定所得蠲蘸GST．p28和GST．UCH 酶动力学参数，说明卵母细胞中p28可麓与小鬣UCHL1奇类似的生 物学功能。 高温卵和低温卵中的p28的SDS／PAGE电泳行为和UCH 活性都未检测到明显差异。Anti-p28单抗可以和原核表达的p28和显性 C(90)S特异缁合，但不识别小鼠的UCH 失活突交类型p28 L1；Anti—p28 单抗自％够和p28结合但不能封闭它的UCH活性，因为当anti—p28注入卵 姆缨腿内，则孕嗣诱导的GVBD受到抑制，褥出p28以不依赖其UCH 活蛙躲方式参与GVBD调节。 在∞S-Met掺入卵母细胞蛋白质合成的实验中，没有发现高温卵转 入低温环境下孵育时卵母细胞mRNA的翻译增加，不同的温度下孵育 的卵母绷胞的蛋白提取物，经p13-agarose吸附实验观察到p28和p13 之阕存在关联：但p28的楣戍条带中来发现有驰S-Met的掺入。 4B能够吸醛一秘分子量为26kDa的蛋龟，这秽蛋白约 GST-Sepharose 对应条带有孙S-Met的掺入，健我锅来发现这种强舀吴毫低瀑诱导表达 现象。针对p28的mRNA的反义骞聚脱氧核糖核蕾酸能显徽注射实验 、 表明，在孕酮诱导的卵母细胞成熟过程不依赖p28的翻译。0 3 尘奎垄塑篷箜鹫查!世竺型!—苎 曼苎型竺型竺烹竺型苎苎苎曼竺曼竺烹竺烹!!!=!===》一 爨母缨腮熬受疫组化实验表骥，在备期!!!婴腿孛郝含誊p28，瓤