盐胁迫诱导的TabZIP60转录因子的筛选与分析（原版论文）.pdfVIP

一 18一 江苏农业科学 2013年第41卷第8期 刘 骥，王 燕，郭建华，等．盐胁迫诱导的TabZIP60转录因子的筛选与分析[J]．江苏农业科学，2013，41(8)：18—22 盐胁迫诱导的TabZIP60转录因子的筛选与分析 刘 骥 ，王 燕 ，郭建华 ，刘晓兰 ，孔秀英 (1．齐齐哈尔大学食品与生物工程学院，黑龙江齐齐哈尔 161006；2．中国农业科学院作物研究所，北京 100081) 摘要：筛选与鉴定耐盐相关基因是培育抗盐品种的基础。植物转录因子在植物的生长发育及其对外界环境的反 应中起着重要作用。利用小麦转录因子全长eDNA文库，运用 Re—Northern和半定量 RT—PCR相结合的方法，从小 麦全长转录因子eDNA文库的526个转录因子进行了盐胁迫筛选，获得了与小麦抗盐相关的转录因子TabZIP60，分析 这个转录因子的序列并进行了功能分析，获得如下结果：TabZIP60的长度是 1741bp，编码 338个氨基酸；TabZIP60 受高盐诱导后表达量明显升高；GFP亚细胞定位表明该转录因子是一个核定位蛋白。 关键词：TabZIP60；盐胁迫；转录因子；序列分析 中图分类号：Q785 文献标志码：A 文章编号：1002—1302(2013)08—0018—04 盐胁迫可以导致植物的生理干旱，对植物的生长发育有 1．2 方 法 显著的影响。植物对盐胁迫的应答，表现为体内的生理生化 1．2．1 eDNA宏阵列膜的制备 从 中国农业科学院小麦遗 变化 ，这是由植物中大量与耐盐相关基因的表达水平变化而 传资源实验室小麦全长 eDNA转录因子数据库中搜索得到 引起的 ]。基因在转录水平上的调控是植物盐胁迫应答过 bZIP转录 因子基 因序列 76条，将其命名为 TabZIP1至 程中极为重要的一环。当植物细胞感受到外界高盐信号时， TaZIP76。然后从全长eDNA文库中挑选相应的cDNA克隆 一 些跨膜受体蛋白接受胞外信号，并随即引发相应的信号传 并提取质粒，将质粒浓度调整至约为 100rig／ ，保存于384 导途径 ，使相关基因表达，形成相关的网络信号途径。当胁迫 孑L板中。利用Q—Pix(GENETIX)将质粒转移到Hybond—N 信号传递到转录因子后，转录因子能与某一类或某基因启动 尼龙膜 (AmershamBiosciences公司)上，每个克隆点4个重 子区域中的特异顺时作用序列结合 ，激活RNA聚合酶转录复 复，形成边长为 1．75mm 的正方形，不 同克 隆间距离为 合物，从而促使或增强基 因在胁迫条件下的转录表达 。。 2．25mm。以小麦 Tubulin基因作为阳性对照，水作为阴性对 然后通过基因产物的作用对外界信号在生理生化等方面做出 照，与bZIP转录因子的质粒同时点到尼龙膜上。自然风干 适合的调节反应。有许多转录因子参与这一调节过程，如 ： 后 ，放在变性液 (0．4mol／LNaOH，1mol／LNaC1)中变性 MYC、DREB、MYB、bHLH、NAC、bZIP、C2H2等 一。bZIP 15min，再在中和液 [0．5mol／LTris—HC1(pH值7．2)，1mol／L (bade—regionleueinempper)是一类碱性亮氨酸拉链转录因 NaC1]中浸泡 15min，最后用蒸馏水漂洗 3min。将膜放到滤 子，是真核生物转录因子中分布最广泛、最保守的一类转录因 纸上晾干，4℃保存备用。 子 。研究表明，bZIP转录因子参与植物的生长发育 、 1．2．2 cDNA宏阵列杂交和扫描 取250mmol／LNaC1处理 光信号的传递、生物与非生物胁迫的应答反应、种子贮藏基因 后不同时间段的茶淀红小麦根提取总RNA，利用反转录法标 的表达等 。我们利用小麦转录因子全长 eDNA文库筛选 记探针。反转录反应体系总体积为20 ，在0．2mL离心管 到了TabZIP60，并对其进行了抗盐功能验证。 中力口入 1 L500 mLOligo(dT)8，1Ixg总RNA，