《利用重叠延伸PCR快速构建中国株乙型肝炎病毒的感染性克隆》.pdfVIP

南 通 大 学 学 报 （ 医 学 版 ） · · Journal of Nantong University (Medical Sciences) 2013 ∶ 33 （6 ） 461 利用重叠延伸 PCR 快速构建中国株乙型肝炎病毒的感染性克隆 * 孙 伟 1** ， 鲍 静 1**# ， 陆仁飞 2 ， 杨 帆 3 ， 张 娜 3 ， 朱丹丹 1 ， 段义农 1*** (1 南通大学医学院病原生物学系 南通 226001 2 南通市第三人民医院检验科 3 南通大学公共卫生学院 ) ， ； ； 摘 要 目的 体外扩增中国株乙型肝炎病毒 的基因组全长序列 快速构建中国株 感 ： ， ， [ ] (hepatitis B virus HBV) HBV 染性克隆 建立中国株 体外复制细胞模型 方法 设计保守引物 扩增 全长基因组序列 对扩增到的 基 ， HBV 。 ： ， HBV 。 HBV 因组进行 DNA 测序及计算机辅助分析 ，确定病毒的基因型 。 通过重叠延伸 PCR(splicing by overlap extension PCR ，SOE- PCR)技术 ，构建 1.3 倍基因组长度的 HBV 感染性克隆质粒 pHBV1.3 。 将 pHBV1.3 质粒转染人肝癌细胞系 HepG2 ，采用 Western Blot 、酶联免疫吸附试验及 Real-PCR 检测病毒复制及表达情况 。 检测该感染性克隆对临床抗病毒药物阿德福 韦的敏感性 。结果 ：成功扩增到 1 株 C 基因型 HBV 全长基因组 ，其 GenBank 登陆号为 KF495606 。构建了中国株 HBV 感 染性克隆 pHBV1.3(C)质粒 ，该质粒能在肝癌细胞株中进行有效的复制 、转录和表达 。 阿德福韦能在体外抑制该 HBV 感 染性克隆的复制 ，抑制程度依赖于药物浓度 。 结论 ：利用 SOE-PCR 可快速构建 HBV 感染性克隆 ，所构建的感染性克隆 能介导高水平病毒复制 ，可用于 HBV 复制机制和抗病毒等方面的研究 。 [关键词] 乙型肝炎病毒 ；C 基因型 ；感染性克隆 ；复制 ；表达 中图分类号 ， 文献标志码 文章编号