《拟穴青蟹（Scylla paramamosain）蛋白二硫键异构酶基因的分子克隆与表达分析》.pdfVIP

第 44卷 第 6期 海 洋 与 湖 沼 Vb1．44．No．6 2013年 11月 0CEAN0L0GIA ET LIMNOLOGIA SINICA NOV．．20l3 拟穴青蟹(Scyllaparamamosain)蛋白二硫键 异构酶基因的分子克隆与表达分析术 曾祥兰 刘元婧 曾 慧 黄辉洋 叶海辉① 王桂忠 (厦 门大学海洋与地球学院 厦 门 361005) 提要 蛋 白二硫键异构酶(PDI)是 内质 网中的关键酶，参与蛋 白合成过程中二硫键的形成 、还原和 异构。本文首次从拟穴青蟹(Scyllapararnamosain)克隆获得 了PDI基因cDNA全长，该序列长度为 2015bp，开放阅读框为 1452bp，编码483个氨基酸。荧光定量PCR检测发现PDI存在于拟穴青蟹的 多个组织中；在拟穴青蟹卵巢发育过程中，PDI基因的表达量在前4个时期逐渐上升，到了第5期(成 熟期)表达量则下降，表明PDI参与了卵巢发育的蛋 白合成过程。免疫组化表明，拟穴青蟹卵母细胞 存在PDI阳性反应，进一步为该分子参与卵巢发育提供 了形态学证据。 关键词 蛋 白二硫键异构酶；拟穴青蟹；卵巢发育；荧光定量；免疫组化 中图分类号 $917．4 蛋 白质合成发生在每一个真核生物中，其 中折 Noiva，1994；Puigelal，1994)，抑制错误折叠蛋白的 叠过程也是必需的。至今仅有两个酶被确定为折叠酶 聚集，如 3．磷酸甘油醛脱氢酶和硫氰酸酶(Caietal， 一 个是肽基脯氨酸异构酶(peptidylprolylisornerase， 1994；Songetal，1995)。此外，PDI还与酵母生孢反 PPI)(Rahfeldetal，1994)，另一个是蛋白二硫键异构 应、T细胞抗原呈递、前胶原成熟加工等多种生物过 酶(proteindisulfideisomerase，PDI)(Freedmanetal， 程有关，甚至构成 了另一些酶 的亚基，如人脯氨酰 1994)。PDI蛋白于 1963年首次由Anfinsen等从人肝 ． 4．羟化酶p亚基(Pihlajaniemietal，1987)。Liao等 组织中分离纯化(熊向华等，2005)；该基因于 1985年 (2008)对长角血蜱 (Haemaphysalislongicornis)的研究 首次 由Edmen等从大鼠肝 中克隆测序(Edmenetal， 显示PDI可能与卵巢发育有关：对长角血蜱PDI的一 1985)。目前已知 PDI广泛存在于不同物种中，包括 个亚型 PDI．1进行 RNA干扰后，其卵巢发育受到严 真菌、植物、动物和人，通过 内质网驻留信号驻留在 重影响，大部分卵子无法成熟，而看似成熟的卵子 内质网中，是内质网中含量最丰富的蛋白之一，含量 40d后仍然无法排卵。 达到mmol水平(Noivaetal，1992；熊向华等，20051。 目前，在脊椎动物 、大豆 、小麦 、酵母等物种 中 作为蛋白折叠催化剂，PDI催化蛋白形成二硫键(氧化 已经克隆得到了PDI基因(Shimonietal，1995)，但在 活性)和催化错误配对二硫键 的重排 (异构酶活 甲壳动物中对该基 因的研究甚少 (刘元婧等，2009)， 性)(Gilbert，1998；Wilkinsonetal，2004)。二硫键的形 有关 PDI在卵巢发育过程中的作用 尚未见诸报道 。拟 成是许多蛋白折叠途径中的限速步骤，PDI则是二硫 穴 青 蟹 (Scyllaparamamosain)隶 属 节 肢 动 物 门 键形成、异构化和重建的关键限速酶(Freedmanetal， (Arthropoda)、甲壳纲(Crustacea1、十足 目(Decapoda)、 1994；Darbyetal，1995；Gilbert，1998)。进一步的研究 梭子蟹科(Portunidae)、青蟹属(Scylla)，