双歧杆菌免疫学检测方法的研究.pdfVIP

厂 一 维普资讯 第 18卷第 2期 无 锡 轻 工 大 学 学 报 Vo1．18，No．Z 1999年 6月 JournalofW uxiUniversityofLightIndustry Jun．，l999 文章编号 ：1001—7453(1999)02—0028．05 双歧杆菌免疫学检测方法的研究 f2＼ 孙无(锝震轻工，张大学食灏品学院解晴，厉凡 ， 江 苏无锝 214036) 摘要：建立双歧杆菌快速检测方法——间接 ELISA法．应用职歧杆菌细胞壁作为抗原所获 关中国键分类词号：!鼠五歧丽杆菌迫疫—学方蔽法f检测： ErEL＼＼，h’。 国内外诸多专家学者对双歧杆菌深入、广泛的研究表明：双歧杆菌是人类及某些动物肠 道 中对机体有益的正常菌，它与机体的健康状况密切相关，关于细菌分类鉴定 ，目前国内外 常采用的方法有 ：传统的生物学培养法 ，代谢产物法 ，核酸分子杂交技术 ，基因型分析法 ，菌 细胞蛋白凝胶电泳谱分析技术，酶免疫学方法及PCR技术等．至于双歧杆菌制 品质量的鉴 定，目前一般仍采用传统的生物学培养法．双歧杆菌是一种严格厌氧菌 ，现有的检测方法或 需特殊的设备 ，或操作复杂、耗工费料，很难达到快速、准确的检测要求．本文 旨在通过对双 歧杆菌的血清学研究，利用抗原抗体间特异性结合的特性建立一种灵敏、快速 、简便的方法 ， 从而为利用ELISA技术快速检测双歧杆菌提供理论依据 l 材料与方法 1．1 供试菌株 1)两歧双歧杆菌F一35(BifidobacteriumbifidumF一35)；作者所在实验室保存，从正常 婴儿粪便中分离获得， 2)双歧杆菌 XS(Bifidobacteriumsp．XS)：作者所在实验室从市售双歧制剂中分离获 得 “3． 3)其它种属的细菌；作者所在实验室分离、鉴定和保存． 收稿 日期 ：1998-11-13f修订日期 ：1998—02—26 基金项 目：江苏省应用基础研究项 目(BJ97OOO8) 作者简介 ：孙 震 (1966年 3月生)，女 ，山西太原人 ，医学硕士 ，讲师 28 维普资讯 1．2 检测样品 国内有关企业生产的双歧制剂 ，分别编号． 1．3 实验动物 ICR小 鼠，购 自江苏原于医学研究所．6～8周龄 ，雌雄随机． 1．4 酶标抗体 购 自上海细胞所，工作浓度 l：2000． 1．5 培养基 MRS液体培养基口]． 1．6 免疫原 (细胞壁)的制备 方法[ ：双歧杆菌接种于MRS液体培养基 中，39C‘厌氧培养 24h后 ，1000g离心，收 获菌体 ，以0．9 NaCl(预冷)洗涤 2次 ，高速均质机 13000r／rain，1rain；l000g离心，弃沉 淀；20000g，4℃冷冻高速离心，20rain，弃上清液 ；生理盐水洗涤 2次 ；分别加入质量浓度 为 10g／L的胰蛋 白酶，10mg／mLDNA酶 37C，2h{20000g离心，弃上清液 ；加 1o 三氯 醋酸，35C，24h；以生理盐水洗涤 2次 i丙酮，乙醚依次洗涤、脱水、干燥． 1．7 免疫血清的制备 用生理盐水稀释免疫原 (细胞壁)至质量浓度为 1mg／mL，每只小鼠每次背部皮下多点 注射 0．1mL；第一次注射时将稀释的免疫原与等量的弗氏完全佐剂充分乳化，以后的4次 注射 ，则与等量的不完全佐剂乳化，注射间隔时间 14d．最后一次注射后 3d，摘眼球放血处 死 ，离心 ，收集血清． 1．8 待剥抗原的制备 1．8．1 待测细胞碎 片抗 原的制备 将收获的菌体细胞用pH9．6的碳酸包被液洗涤 2次 ， 调整细胞浓度至 i0emL～，用高速均质机 以13000r／rain进行 lrain破碎，使用时用碳酸包 被液稀释至不同浓度 ，用于检测． 1．8．2 待测完整全细胞抗原的制备 将收获的双歧杆菌细胞，以0．9 的NaCI洗涤 2次 ， 以i00℃ 5rain热致死，用 pH9．6的碳酸包