拟南芥下胚轴向光弯曲不敏感突变体筛选及相关基因克隆.pdfVIP

摘 要 植物体为更好适应自然环境，在其长期进化过程中形成诸多适应外界环境的能力。 其中向光性反应就是为更多获得光源的一种适应反应。蓝光受体向光素的发现，为深入 研究蓝光诱导的向光性信号转导机制提供新的途径。向光素PHTO1 、PHOT2 感受蓝光 后，与其下游信号蛋白NPH3 和RPT2 相互作用，调节生长素运输载体AUX1 和PIN1 的活性及定位、从而使拟南芥黄化苗下胚轴向光侧和背光侧中生长素分布不均匀，导致 向光弯曲。但是蓝光信号如何调节向光弯曲的机制尚不完全清楚。 本实验以蓝光受体phot1 突变体为材料，通过0.3% 乙酰甲基磺酸(EMS)诱变，应用 100 µmol m-2s-1 的单侧蓝光处理12 h，对其M2 代幼苗进行大规模的筛选。获得3 株潜 在突变体，分别命名为sph1 (slow phototropic hypocotyl 1) 向光性迟缓突变体、lph1 （littery phototropic hypocotyl 1 ）向光性杂乱突变体以及dph1 （deletion phototropic hypocotyl 1) 向光性缺失突变体. 研究发现，与phot1 突变体相比，sph1 突变体除在100 µmol m-2s-1 单侧蓝光刺激下 向光弯曲反应迟缓之外，其在25 µmol m-2s-1 红光下部分失去负向重力性，1 µmol m-2s-1 的蓝光可以恢复这种现象。将sph1 突变体与Ler 杂交，观察F1 代和F2 代的表型分离 比，证实sph1 为单基因隐性突变。通过图位克隆，将其定位在MSF3 BAC 上，经测序 发现该突变体在At2G18790.1 基因DNA 序列的第3482bp 发生了点突变，由原来G 变为 A，蛋白质序列分析后发现，由于三联子密码GCC 突变为ACC ，因此第1096 个氨基酸 发生突变，即由丙氨酸突变为苏氨酸，因此可以推测点突变所造成的蛋白质序列的变化 会直接导致其向光反应迟缓。 以phot1 突变体为对照材料，对sph1 突变体进行一系列的表型鉴定，观察它们 在生长发育方面的差异。结果显示营养生长时期sph1 突变体较phot1 突变体相比，其 叶片狭小、叶柄较长且逆时针螺旋排列、幼苗茎较长，同时气孔开度和密度较低、失水 较慢、叶片温度较高，但其最终结实量同phot1 突变体无明显差异。其原因可能是sph1 突变体通过较长的叶柄逆时针螺旋排列、相对较长的茎等多种方式调节避荫反应，使其 叶片根据光线调整位置从而最大限度获得光能，进行光合作用，积累能量，最终对结实 量无影响。 I 对于lph1 和dph1 突变体，通过与Ler 杂交后F1 代和F2 代表型分离比，证实lph1 和dph1 同样为单基因隐性突变。目前已将lph1 粗定位在拟南芥第五条染色体的底部， dph1 粗定位在第四条染色体的中部。 以上研究结果表明，SPH1、LPH1 、DPH1 可能参与调控向光素介导的强蓝光向光 弯曲的信号转导，但具体机制有待进一步研究。 关键词：蓝光，向光素，向光弯曲，突变体筛选，图位克隆 II ABSTRACT For the better adaptation to environment and resistance to adverse circumstance, the plant has formed many abilities to adapt external environment in the long-term evolution process. The phototropism is in the case, which enables plant to bend towards light so that they are able to obtain optimum light. The discovery of blue light receptors phototropin (PHTO1,PHOT2), which provided the new