Chapter亲和纯化..pptVIP

第八章 亲和色谱 生物亲和作用（bioaffinity） 定义： 　生物分子能够区分结构和性质非常相近的其他分子，选择性地与其中某一分子相结合，生物分子间的这种特异性相互作用称为生物亲和作用或简称亲和作用。 通过亲和作用发生的结合称特异性结合（specific binding）或亲和结合（affinity binding）。 亲和纯化技术 定义：利用生物分子间的特异性结合作用（亲和作用）的原理进行生物物质分离纯化的技术。 分类：亲和色谱技术、亲和膜分离技术、亲和沉淀、亲和反胶团、亲和电泳等。 第一节 生物亲和作用 一、亲和作用的本质 参与亲和作用的两个分子中，其中之一为蛋白质的情况占绝大多数，或者两者均为蛋白质。 蛋白质参与亲和作用的机理 一般认为蛋白质的立体结构中存在结合位点，呈凹陷或凸起结构。 具有亲和作用的分子间还需分子或原子水平的各种相互作用，主要包括静电作用、氢键力、疏水性相互作用、配位键、弱共价键等。 生物亲和作用是一种复杂的生物现象，这也是亲和作用特异性高的主要原因。 二、影响亲和作用的因素 1.离子强度(I↑，氢键力↓，亲和作用↓ ； I↑，疏水性相互作用↑，亲和作用↑ ） 2.pH（根据蛋白质解离基团的pKa值而定,如解离基团为羧基，pH应高于其pKa值，带电量最高，静电作用力大， pH严重影响亲和作用，存在最佳pH，使亲和作用最大 ） 3.抑制氢键形成的物质(脲和盐酸胍会抑制氢键形成，亲和作用↓ ） 4.温度（T ↑,疏水性相互作用↑;静电作用、氢键力、配位键作用↓） 5.离液液体（离子半径大、电荷密度低的阴离子如SCN-, I- ，CLO4-等减弱疏水性作用，亲和作用↓ ） 6.鳌合剂（除去金属离子，影响配位键的形成，抑制亲和作用 三、亲和作用体系 亲和作用体系的特异性 高度特异性体系：一对一关系，如抗原与其单克隆抗体的结合、酶与底物的结合。 群特异性体系：大多数亲和体系，亲和作用不具备绝对的特异性，如外源凝集素可与任何含有糖基的蛋白质结合、酶与辅酶或金属辅基的结合。 结合常数 第二节 亲和色谱原理 一、原理　 利用键合了亲和配基的亲和吸附介质为固定相亲和吸附目标产物，不同蛋白质分子对固定化在载体上的亲和配基具有不同的识别和结合能力，根据亲和吸附作用力的差异，使目标产物得到分离纯化的液相色谱法。 基本过程： ?固相化 ? (Immobilise) 二、亲和色谱操作 ?步骤： 进样、吸附：含有目标产物的料液连续通过亲和色谱柱，直至目标产物在色谱柱出口穿透为止（与固定床吸附操作相似） 清洗：用清洗液（与原料溶解液的组成相同的缓冲液）除去非特异性结合的杂蛋白 洗脱：特异结合在配体上的靶蛋白最后可用能使其与配基解离的溶液（洗脱液）洗下。 再生：用清洗液清洗，使色谱柱的PH和离子强度适合于亲和吸附 注意事项 　1.）当两种以上蛋白质同时被吸附时，可采用线性梯度洗脱或逐次洗脱法分离 　2）为提高分离度，应采取较小的进料量（远低于发生穿透所需的进料量） 第三节　亲和色谱介质 制备亲和色谱介质的意义： 　亲和吸附作用只有在特定配基的存在下才能实现，多数情况下需根据目标产物选择合适的亲和配基修饰固定相粒子，制备所需的亲和吸附介质。 　进行外源凝集素的亲和纯化时，无需自制亲和吸附介质。可直接选用商品化凝胶介质（含有糖基介质）。 亲和吸附剂及其制备方法（p322） 载体的选择 配基的选择 　载体应具备的特征： 具有亲水性多孔结构，无非特异性吸附，比表面积大； 物理和化学稳定性高，有较高的机械强度，使用寿命长； 含有可活化的反应基团，用于亲和配基的固定化； 粒径均一的球形粒子。 可供选择的载体 琼脂糖凝胶 聚丙烯酰胺凝胶 葡聚糖凝胶 配基应具备的特性： 1.对于欲纯化的生物物质应具有专一亲和性 2.必须具备能被修饰的功能基团 配基可以是小分子物质：一些辅酶、辅基 大分子物质：酶、抗体 纯化酶的配基:底物、抑制剂、辅酶、辅基等； 纯化抗原抗体的配基：互为配基 纯化核酸的配基：DNA和RNA，蛋白质和mRNA 固相化技术：将配基以共价键连接于不溶于 水的固相基质上制成固相化吸附剂 过程：载体活化、接臂　 　　 CNBr活化法 环氧基活化法 硅胶的活化 接臂：在配基与载体之间连接一个“间隔臂”，以增大小分子配基与在载体之间的距离,克服载体空间位阻的影响，使配基与生物大分子有效亲和结合 第四节　亲和吸附平衡（略） 第五节　亲和色谱过程分析 亲和色谱操作过程 上样吸附 清洗（洗涤） 洗脱 再生 1、进料吸附（p329) 亲和色谱操作中可能存在的两种吸附： 亲和吸附：亲和配基与目标分子间的特异性