小麦低分子量麦谷蛋白亚基分离及其密码子使用特征研究.pdf

中文摘要 根据不同分子量蛋白质在十二烷基硫酸钠- 聚丙烯酰胺凝胶电泳 （SDS）迁移率不同，小麦（Triticum aestivum L. ）麦谷蛋白亚基分为高 分子量麦谷蛋白亚基（HMW-GS ）和低分子量麦谷蛋白亚基（LMW-GS ）。小麦 HMW-GS 和 LMW-GS 互作形成空间网格状结构决定小麦面包烘烤品质。然而 小麦LMW-GS 研究相对滞后。因此，获得我国独立的自主知识产权的LMW-GS 功能基因，并用于改良我国小麦面包烘烤品质已迫在眉睫。 该论文首先以国内优质强筋小麦中优 9507 为实验材料，通过优化 SDS技术蛋白质分离条件，分离小麦LMW-GS 区段的特异条带，质谱鉴 定获得肽段；进一步分析小麦麦谷蛋白亚基基因密码子使用特性，采用RT-PCR 和RACE 技术克隆目的基因核酸片段，建立小麦LMW-GS 基因克隆技术体系。 在此基础之上，以新疆本地主栽强筋小麦新春 8 为实验材料，锁定小麦面包烘 烤品质主效 LMW-GS ，质谱鉴定获得肽段，为后续该小麦面包烘烤品质主效 LMW-GS 基因克隆、小麦HMW-GS 和LMW-GS 互作研究提供科学的数据参考。 该论文主要研究结果如下： 含0.3mol/LNaI 和1.4%4-VP 的LMW-GS 提取液能有效提取小麦LMW-GS 成分。在此基础上，当分离胶浓度为 T=14%/C=3%、分离时间为 40h、电极缓 冲液为Tris-硼酸或Tris-甘氨酸时，能更加有效、准确、且重复性高地分离数目 庞大的小麦LMW-GS 。该技术体系为小麦LMW-GS 深入研究的第一个限速步骤 提供了良好的解决方案。 从国内优质强筋小麦中优 9507 中锁定 1 个小麦面包烘烤品质可能相关的 LMW-GS ，命名为ZY9507-L1 ，其表观分子量为34kD。质谱鉴定获得5 个肽段， 分别命名为 ZL1-1、ZL1-2 、ZL1-3、ZL1-4、ZL1-5 。其中，ZL1-1 （肽段序列： GIIQPQQPAQLEVIR ）与 NCBI 数据库中小麦已知 LMW-GS 氨基酸序列 （GenBank 登录号：ACJ76961.1 ）的覆盖率（Query coverage ）为66%，ZL1-2 （肽段序列：SVVHSIIMQQEQR）与小麦已知LMW-GS 氨基酸序列（GenBank 登录号：ABB04903.1 ）的Query coverage 为92% 。其余3 个质谱鉴定获得的小 肽段均与NCBI 数据库中小麦已知LMW-GS 氨基酸序列不存在相似性。 为了解小麦麦谷蛋白亚基基因密码子使用特性，该文运用CodonW 1.4.2 和 SPSS16.0 软件对 13 个来源于小麦麦谷蛋白亚基基因的密码子用法特性进行了 分析。结果显示，除1Dy10 基因有效密码子数（ENC 值）小于40 外，其余亚 基基因ENC 值均介于40-50 之间；密码子第三位GC 含量（GC3 ）均在0.38-0.45 I 之间；1Bx14 基因偏向于使用A 或T 结尾的密码子，其余12 个亚基基因偏向于 使用G 或C 结尾的密码子；1Dy10 与其余 12 个亚基基因间距离系数较大，然 而各组染色体麦谷蛋白x-型或y-型亚基基因间距离系数较小。结果表明，小麦 麦谷蛋白亚基基因具有较强的密码子使用偏爱性，各基因密码子用法上具有相 似性，每一种氨基酸均存在 1-2 个偏爱密码子。在密码子用法差异上表现为， 除1By9 和1Dy10 之外，无论是A 染色体组、B 染色体组，还是D 染色体组， 各组染色体上麦谷蛋白x-型或y-型亚基基因间密码子使用频率差异最小。这一 分析结果对小麦HMW-GS 功能基因资源的高效利用和LMW-GS 新基因的克隆 具有一定的指导意义。 根据小麦面包烘烤品质相关LMW-GS ZY9507-L1 质谱鉴定结果和小麦麦谷 蛋白亚基基因密码子使用特性，该文以国内优质强筋小麦中优9507 为实验材料， 利用ZL1-1 肽段设计3’端上游引物，采用RT-PCR 和RACE 技术获得目的基因 ZL1-13’端序列。结果显示，分离获得 2 个不同的 LMW-GS 基因序列，分别命 名为ZL1-1