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SDF-1 α基因的克隆及其对THP-1 细胞的迁移作用 （摘 要） 研究生：姚 峰 导 师：王 佐 动脉粥样硬化是一种动脉血管壁慢性炎症性疾病，其确切机制还未完全阐 明，很多因素可促进其发生发展。而趋化因子是炎症的关键调节因子。基质细胞 衍生因子SDF-1 α（stromal cell derived- factor 1 alpha ）是一类具有趋化活性的细 胞因子，研究证实它在造血干细胞迁移及归巢、恶性肿瘤尤其血液肿瘤的浸润转 移以其HIV 感染方面发挥着重要作用。近几年来SDF-1 α在动脉硬化性疾病中的 作用也开始引起重视。 本研究应用 RT-PCR 法从大鼠血管平滑肌细胞（Vascular smooth muscle cells,Vsmcs;）中克隆出SDF-1 α基因，并对其序列进行初步的生物信息学分析； 然后构建 EGFP-C1- SDF-1 α重组质粒进行亚细胞定位分析；最后构建重组质粒 pcDNA3.1-SDF-1 α,研究其对单核细胞的趋化作用。 目的：克隆大鼠 SDF-1 α 基因，并对大鼠SDF-1 α 基因序列进行分析；分析 SDF-1 α蛋白亚细胞定位；探讨重组SDF-1 α蛋白对单核细胞的趋化作用。 方法：从大鼠Vsmcs 中提取mRNA,用RT-PCR 从中扩增出SDF-1 α基因,将扩增片 段克隆于pMD-T18 载体中,转化DH5 α菌；进行蓝白筛选后,运用PCR 和酶切鉴定 并 DNA 测序；利用生物信息学方法对 SDF-1 α 基因的序列进行分析。构建 EGFP-C1- SDF-1 α表达载体，酶切鉴定，脂质体转染法将重组质粒瞬时转染 Ecv304 内皮细胞株,48h 后用荧光显微镜检测绿色荧光蛋白表达；构建重组质粒 pcDNA3.1-SDF-1 α，脂质体转染法转染Ecv304 内皮细胞株，经G418 筛选阳性克 隆，RT-PCR 验证，建立 SDF-1 α转基因稳定表达细胞系，再用小室迁移实验来 研究SDF-1 α对THP-1 单核细胞的趋化作用。 1 结果： PCR 扩增得到378bp 的基因片段,经酶切初步证实为SDF-1 α基因;阳性 克隆经筛选鉴定连接有目的基因;目的基因测序结果与GeneBank 上序列比较,结 果完全一致,表明靶基因成功插入pMD –T；用脂质体转染法将重组质粒EGFP-C1- SDF-1 α瞬时转染内皮细胞,发现绿色荧光蛋白主要在细胞质中表达；用脂质体转 染法将重组质粒pcDNA3.1-SDF-1 α转染法转染内皮细胞，经G418 筛选阳性克隆， RT-PCR 验证，表明建立了 SDF-1 α转基因稳定表达细胞系，小室迁移试验发现 SDF-1 α对THP-1 单核细胞的具有明显趋化作用。 结论：成功克隆了 SDF-1 α 基因，SDF-1 α蛋白主要在细胞质中表达，重组的 SDF-1 α对单核细胞具有趋化作用。 关键词：SDF-1 α；PCR；克隆；真核表达载体；亚细胞定位；趋化；动脉粥样硬 化； 2 Cloning of SDF-1 αgene and effect on Migration of THP-1 (Abstract) Atherosclerosis is now viewed as an inflammatory disease of the vascular system, there are so many factors involve in enhancing its development, yet its mechanism remains unclear. Stromal cell –derived factor-1 (SDF-1) is a sort of chemotactic cytokines.Recent publications indicate that the SDF-1 α plays a pivotal role during development and in many patho-physiological